本文選題：轉(zhuǎn)氨酶 + 手性胺　； 參考：《太原理工大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：手性胺和手性鄰氨基醇類化合物在手性醫(yī)藥工業(yè)、有機(jī)配體、手性助劑、拆分劑以及光學(xué)顯示材料等方面有廣泛的應(yīng)用。生物催化具有高效率、高選擇性、反應(yīng)條件溫和和環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn),因此,比傳統(tǒng)化學(xué)催化法更具有吸引力和競爭力。ω-轉(zhuǎn)氨酶反應(yīng)過程無需輔酶循環(huán)再生吸引了大批研究者的關(guān)注。本課題以手性鄰氨基醇特異性轉(zhuǎn)氨酶為研究對象,通過顯色法構(gòu)建了轉(zhuǎn)氨酶高通量篩選方法;通過構(gòu)建的高通量篩選方法獲得了一株高活力高選擇性鄰氨基醇轉(zhuǎn)化菌株;通過基因組挖掘技術(shù)從目的菌株中成功克隆到4個(gè)新型轉(zhuǎn)氨酶,并對其在大腸桿菌中進(jìn)行了高效表達(dá)、純化及表征,同時(shí)對其底物特異性進(jìn)行了分析。首先,利用模板底物2-羥基苯乙酮與無色2,3,5-三苯基-2H-四唑氯化物(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)反應(yīng)生成的紅色TPF(簡稱顯色反應(yīng))在波長510 nm處有吸收值這一原理,建立了一種高效、快速、靈敏的高通量轉(zhuǎn)氨酶篩選方法。該顯色反應(yīng)的適宜pH范圍是6.0-10.0,適宜溫度范圍是20oC-30oC,顯色反應(yīng)時(shí)間約3-5 min。該方法在以苯甘氨醇為底物時(shí),底物轉(zhuǎn)化率水平的靈敏度范圍為1.6%-32.5%,且該方法對細(xì)菌的全細(xì)胞具有很好的適用性。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建的高通量篩選方法成功篩選得到一株對苯甘氨醇催化活性較高且選擇性專一的惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida NBRC 14164)。其次,運(yùn)用基因組挖掘技術(shù),從Pseudomonas putida NBRC 14164的基因組中挖掘到與ω-轉(zhuǎn)氨酶cv2025的氨基酸序列同源性分別為37%、35%、56%和58%的pp21050、ppbaua、pp36420、ppspuc四種ω-轉(zhuǎn)氨酶基因序列,構(gòu)建表達(dá)載體于大腸桿菌中成功可溶性表達(dá)。對目標(biāo)蛋白進(jìn)行了鎳柱純化,經(jīng)sds-page檢測得到電泳純的轉(zhuǎn)氨酶。再次,以外消旋苯乙胺為底物對純化后的ω-轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)pp21050、ppbaua、pp36420和ppspuc四種轉(zhuǎn)氨酶酶活最佳ph分別為9.0、10.0、8.0和9.0;最適溫度分別為35oc、50oc、35oc和35oc;ppbaua具有相對較好的酶活溫度穩(wěn)定性,尤其在高溫60oc下孵育2h還保留有70%左右的相對酶活,而pp21050、pp36420和ppspuc對溫度敏感,熱穩(wěn)定性較差;pp21050、ppbaua、pp36420和ppspuc的km值分別為161.3mm、136.7mm、398mm、130.9mm;vmax分別為2.8u/mg、0.5u/mg、5.6u/mg、3.6u/mg。其中ppspuc的催化效率最高,達(dá)到0.023mm-1s~(-1),pp21050的催化效率次之,達(dá)到0.015mm-1s~(-1),pp36420的催化效率達(dá)到0.012mm-1s~(-1),ppbaua的催化效率最低僅有0.003mm-1s~(-1)。最后,本課題選擇了4種外消旋胺類化合物和3種不同的外消旋鄰氨基醇類化合物對ω-轉(zhuǎn)氨酶的底物特異性進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)四種轉(zhuǎn)氨酶對鄰氨基醇類化合物和胺類化合物表現(xiàn)出不同的催化活性與立體選擇性。在動(dòng)力學(xué)拆分外消旋胺過程中,四種轉(zhuǎn)氨酶均只對s構(gòu)型胺有催化活性,其中pp21050、pp36420和ppspuc表現(xiàn)出了良好的催化能力,底物轉(zhuǎn)化率大部分能達(dá)到48-50%,ee值也達(dá)到98-99%。在動(dòng)力學(xué)拆分外消旋鄰氨基醇過程中,四種轉(zhuǎn)氨酶均只對r構(gòu)型的鄰氨基醇有催化活性,其中Pp21050、Pp36420和PpspuC對外消旋苯甘氨醇的催化活性較好,轉(zhuǎn)化率分別為50.2%,49.4%和49.3%,ee值達(dá)到99%,97%和99%;PpbauA對底物外消旋2-氨基-1-丁醇和纈氨醇有較高的催化能力,轉(zhuǎn)化率和ee值分別達(dá)到50.0%和99.0%。本實(shí)驗(yàn)還通過Ppspu C動(dòng)力學(xué)拆分外消旋苯甘氨醇成功制備得到S構(gòu)型的苯甘氨醇,收率為45.0%,純度大于99.0%。綜上所述,四種新型轉(zhuǎn)氨酶具有高活力、高立體選擇性和廣泛底物譜的特征,使其在生物法制備手性胺和手性鄰氨醇中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
[Abstract]:Chiral amines and chiral aminophenol compounds have extensive applications in the chiral pharmaceutical industry, organic ligands, chiral auxiliaries, resolution agents and optical display materials. Biocatalysis has the advantages of high efficiency, high selectivity, mild reaction conditions and friendly environment. Therefore, it is more attractive and competitive than traditional chemical catalysis. A high throughput screening method for aminotransferase was constructed with chiral aminoalcohol specific aminotransferase, and a high activity and high selective aminoalcohol transformation strain was obtained by high throughput screening method. 4 new aminotransferase was cloned from the target strain by over genome mining technique, and its expression in Escherichia coli was highly expressed, purified and characterized. At the same time, its substrate specificity was analyzed. First, the template substrate 2- hydroxyacetophenone and the colorless 2,3,5- three phenyl -2H- four azolides (2,3,5-triphenyltetrazolium C) were used. Hloride, TTC) the reaction generated red TPF (abbreviated color reaction) has the absorption value at the wavelength of 510 nm. A high efficient, rapid and sensitive high throughput transaminase screening method is established. The suitable pH range of the color reaction is 6.0-10.0, the suitable temperature range is 20oC-30oC, the color reaction time is about 3-5 min., and the method is with benzoglyol. The sensitivity range of substrate conversion rate is 1.6%-32.5% when the substrate is used as substrate, and the method has good applicability for all cells of bacteria. This experiment successfully screened a strain of Pseudomonas aeruginosa (Pseudomonas putida NBRC 14164) with high catalytic activity and selectivity. Secondly, using genomic mining technology, the homology of amino acid sequences from Pseudomonas putida NBRC 14164 was extracted from the amino acid sequence of Omega transaminase cv2025, which were 37%, 35%, 56% and 58% of pp21050, ppbaua, pp36420, ppspuc and four Omega transaminase gene sequences, which were constructed to achieve the successful soluble expression of the vector in Escherichia coli. The purification of the nickel column was carried out, and the electrophoretic transaminase was obtained by SDS-PAGE. Again, the enzymatic properties of the purified Omega transaminase were studied by the racemic benzoethylamine as the substrate. The experimental results showed that the best pH for the four transaminase activities of pp21050, ppbaua, pp36420 and ppspuc were 9.0,10.0,8.0 and 9, respectively, and the optimum temperature was 35oc, 50oc, respectively. 35oc and 35oc, ppbaua had relatively good enzyme activity temperature stability, especially at high temperature 60oC, 2h still retained about 70% relative enzyme activity, while pp21050, pp36420 and ppspuc were sensitive to temperature and poor thermal stability; pp21050, ppbaua, pp36420 and ppspuc, respectively. In 6u/mg, 3.6u/mg., ppspuc has the highest catalytic efficiency, reaching 0.023mm-1s~ (-1). The catalytic efficiency of pp21050 is second to 0.015mm-1s~ (-1). The catalytic efficiency of pp36420 is reached to 0.012mm-1s~ (-1). The catalytic efficiency of ppbaua is the lowest. Finally, 4 kinds of racemate amines and 3 different racemate adjacent ammonia are selected. The substrate specificity of Omega aminotransferase was studied by the basic alcohols. The experimental results showed that the four aminoalcohols showed different catalytic activity and stereoselectivity for the aminoalcohols and amines. In the kinetic resolution of racemines, the four transaminase had a catalytic activity to the S structure amine, of which pp21050, P P36420 and ppspuc showed good catalytic ability, the conversion rate of substrate could reach 48-50%, and the EE value also reached 98-99%. in the process of kinetic resolution of ortho amino alcohols. The four aminotransferase had a catalytic activity to the ortho amino alcohols of R configuration, of which the catalytic activity of Pp21050, Pp36420 and PpspuC was better. The conversion rates were 50.2%, 49.4% and 49.3% respectively, EE values reached 99%, 97% and 99%, and PpbauA had high catalytic ability for substrate racemization of 2- amino -1- butanol and valerine. The conversion rate and EE value reached 50% and 99.0%. respectively. The S configuration of benzglyl was successfully prepared by the kinetic resolution of Ppspu C, and the yield was 45. The four new aminotransferase has the characteristics of high vitality, high stereoselectivity and broad substrate spectrum, which has the potential application value in the preparation of chiral amines and chiral anaminol in biological process.

【學(xué)位授予單位】：太原理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q55;O621.3

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本文編號(hào)：1788099