本文關(guān)鍵詞：毛細(xì)管在線富集技術(shù)在蛋白激酶活性檢測(cè)中的應(yīng)用

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【摘要】：激酶催化蛋白磷酸化是一種將三磷酸腺苷(ATP)分子上γ-磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至蛋白或多肽底物序列中含有絲氨酸、酪氨酸或是蘇氨酸殘基上的蛋白質(zhì)翻譯后修飾過(guò)程,它在生物體的各項(xiàng)生命活動(dòng)中起到至關(guān)重要的作用,如細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞內(nèi)的生命過(guò)程(生長(zhǎng)、分化、增殖、凋亡等)。在真核細(xì)胞中,用于編碼蛋白激酶的基因占總基因數(shù)的1-3%,而蛋白激酶的活性異�；蚴沁^(guò)表達(dá)與許多已知的疾病如炎癥、癌癥、糖尿病、老年癡呆癥等緊密相關(guān)。因此,通過(guò)測(cè)定特定激酶的活性不僅有益于推動(dòng)基礎(chǔ)生命化學(xué)的研究進(jìn)程,而且對(duì)于理解與激酶相關(guān)疾病機(jī)理有重要意義,并對(duì)生物診斷治療和抗增生藥物研發(fā)具有重要作用。傳統(tǒng)檢測(cè)蛋白激酶活性的方法主要是放射性方法和基于抗體-抗原特異性作用的免疫分析法,但這兩種方法存在著不足之處。其中放射性方法過(guò)程中涉及到對(duì)人類有害的放射性污染物,免疫分析方法的分析成本較高且缺少具有特異性識(shí)別的抗體。因此,新型激酶分析方法陸續(xù)被開(kāi)發(fā)出來(lái),如熒光方法、電化學(xué)方法、表面等離子體共振方法、質(zhì)譜分析方法等。這些方法雖然各具一定的優(yōu)勢(shì),但是也常常涉及到標(biāo)記、孵育、清洗、檢測(cè)等多步過(guò)程,耗時(shí)耗力。因此發(fā)展高效通用的激酶分析方法對(duì)于分析工作者依然是一個(gè)挑戰(zhàn)。綜合上述考慮,本文基于毛細(xì)管在線富集技術(shù)的優(yōu)異富集性能和毛細(xì)管電泳分析方法的高自動(dòng)化及高效分離能力,實(shí)現(xiàn)了對(duì)蛋白激酶活性及其對(duì)應(yīng)的激酶抑制劑的高靈敏度檢測(cè)和篩選。主要內(nèi)容如下：1、基于非連續(xù)電解質(zhì)毛細(xì)管等速電泳技術(shù)(CITP)設(shè)計(jì)了一種在線間接檢測(cè)了蛋白激酶PKA活性的電泳分析方法平臺(tái)。毛細(xì)管等速電泳不僅具有較高的分析效能,而且常常作為一種在線富集手段用以提高毛細(xì)管電泳分析方法的靈敏度。由于PKA激酶催化產(chǎn)生的微量磷酸化多肽經(jīng)由等速電泳技術(shù)在線富集之后被高效分離檢測(cè),因此該方法的最低檢測(cè)限達(dá)到了12.5mU/μL,相較傳統(tǒng)的CZE的最低檢測(cè)限50 mU/μL降低了約4倍,大大提高了該方法分析激酶活性時(shí)的檢測(cè)靈敏度。由于該方法結(jié)合了電泳分析方法的自動(dòng)化和程序化等優(yōu)點(diǎn),所以在高通量分析激酶活性或篩選激酶特定抑制劑有著巨大的應(yīng)用潛能。2、基于毛細(xì)管在線等電聚焦技術(shù)(on-line CIEF)在線富集磷酸化的多肽并高靈敏高效分析PKA蛋白激酶活性。毛細(xì)管等電聚焦不僅具有較高的分辨率,而且常常被用于作為一種高效富集手段用以提高毛細(xì)管電泳方法的靈敏度。在該方法中,分析PKA蛋白激酶活性時(shí)的最低檢測(cè)限為1.25mU/μL,較傳統(tǒng)CZE降低了約40倍,充分表明了on-line CIEF高靈敏度分析的特性。3、基于在線等電聚焦技術(shù)不僅具有較高的檢測(cè)靈敏度而且還具有較高的分離度,因此我們實(shí)現(xiàn)了多種激酶的同時(shí)分析及其抑制劑篩選并且檢測(cè)實(shí)際細(xì)胞裂解液中激酶的活性。其中對(duì)PKA和CDK1兩種激酶各自特異性抑制劑H-89、Ro-3306的抑制活性進(jìn)行了評(píng)估,其IC5o值分別為37.0 nM、35.9 nM。實(shí)驗(yàn)表明,on-line CIEF方法平臺(tái)不僅可以實(shí)現(xiàn)多種激酶活性的同時(shí)分析及其特定抑制劑的高效篩選,而且還可以用于檢測(cè)實(shí)際樣品細(xì)胞裂解液中PKA激酶的活性。
【關(guān)鍵詞】：毛細(xì)管在線富集技術(shù) 等電聚焦 等速電泳 蛋白激酶 激酶抑制劑 高通量篩選
【學(xué)位授予單位】：湖南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q55;O657.8
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第1章 緒論12-27
• 1.1 毛細(xì)管電泳技術(shù)概述12-13
• 1.2 毛細(xì)管電泳在線富集技術(shù)13-18
• 1.2.1 樣品堆積技術(shù)13-16
• 1.2.2 樣品掃集技術(shù)16
• 1.2.3 毛細(xì)管等速電泳技術(shù)16-17
• 1.2.4 毛細(xì)管等電聚焦17-18
• 1.2.5 在線固相富集技術(shù)18
• 1.3 蛋白質(zhì)翻譯后修飾18-25
• 1.3.1 蛋白磷酸化修飾19-20
• 1.3.2 蛋白激酶活性檢測(cè)及其抑制劑篩選20
• 1.3.3 基于比色法檢測(cè)激酶活性20-22
• 1.3.4 基于熒光方法檢測(cè)激酶活性22-23
• 1.3.5 基于電化學(xué)檢測(cè)激酶活性23-24
• 1.3.6 基于毛細(xì)管電泳技術(shù)檢測(cè)激酶活性24-25
• 1.4 本文構(gòu)思25-27
• 第2章 非連續(xù)電解質(zhì)毛細(xì)管等速電泳在線富集磷酸化多肽間接檢測(cè)激酶活性27-35
• 2.1 前言27-28
• 2.2 實(shí)驗(yàn)部分28-29
• 2.2.1 試劑與材料28-29
• 2.2.2 儀器29
• 2.2.3 CITP分析PKA催化的多肽底物和產(chǎn)物29
• 2.2.4 PKA激酶催化多肽磷酸化29
• 2.2.5 CITP檢測(cè)PKA激酶活性29
• 2.3 結(jié)果和討論29-34
• 2.3.1 CITP分析PKA多肽29-30
• 2.3.2 CITP條件優(yōu)化30-33
• 2.3.2.1 前導(dǎo)電解質(zhì)體系中離子種類的優(yōu)化30-31
• 2.3.2.2 前導(dǎo)電解質(zhì)濃度的優(yōu)化31-32
• 2.3.2.3 進(jìn)樣時(shí)間條件優(yōu)化32
• 2.3.2.4 分離電壓條件優(yōu)化32-33
• 2.3.3 不同電泳方法檢測(cè)PKA多肽的比較33
• 2.3.4 激酶工作曲線的建立33-34
• 2.4 小結(jié)34-35
• 第3章 毛細(xì)管等電聚焦在線高靈敏度檢測(cè)PKA激酶活性35-43
• 3.1 前言35-36
• 3.2 實(shí)驗(yàn)試劑、材料與儀器36-37
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑、材料36
• 3.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器36
• 3.2.3 毛細(xì)管等電聚焦用的中性毛細(xì)管的制備36-37
• 3.2.4 毛細(xì)管等電聚焦在線分析PKA催化的多肽底物和產(chǎn)物37
• 3.2.5 PKA激酶催化多肽磷酸化37
• 3.2.6 毛細(xì)管等電聚焦檢測(cè)PKA激酶活性37
• 3.3 結(jié)果和討論37-42
• 3.3.1 On-line CIEF分析PKA多肽37-38
• 3.3.2 條件優(yōu)化38-40
• 3.3.3 不同電泳方法檢測(cè)PKA多肽40-41
• 3.3.4 激酶工作曲線的建立41-42
• 3.4 小結(jié)42-43
• 第4章 在線等電聚焦同時(shí)分析多種激酶及其抑制劑篩選并高靈敏度檢測(cè)細(xì)胞裂解液中的激酶活性43-53
• 4.1 前言43-44
• 4.2 實(shí)驗(yàn)部分44-46
• 4.2.1 試劑和材料44-45
• 4.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備45
• 4.2.3 毛細(xì)管在線等電聚焦結(jié)合激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)分析45
• 4.2.4 同時(shí)檢測(cè)激酶活性和激酶抑制劑篩選45
• 4.2.5 細(xì)胞裂解液中細(xì)胞激酶活性分析45-46
• 4.3 結(jié)果和討論46-51
• 4.3.1 在線等電聚焦富集分析雙重激酶催化多肽混合物46-47
• 4.3.2 雙重激酶活性檢測(cè)47-48
• 4.3.3 激酶抑制劑活性分析48-50
• 4.3.4 癌細(xì)胞裂解液中蛋白激酶活性檢測(cè)50-51
• 4.4 本章小結(jié)51-53
• 結(jié)論53-54
• 參考文獻(xiàn)54-62
• 附錄A 攻讀學(xué)位期間所發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄62-63
• 致謝63

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本文編號(hào)：1059942