本文關鍵詞：毛細管在線富集技術在蛋白激酶活性檢測中的應用

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【摘要】：激酶催化蛋白磷酸化是一種將三磷酸腺苷(ATP)分子上γ-磷酸基團轉移至蛋白或多肽底物序列中含有絲氨酸、酪氨酸或是蘇氨酸殘基上的蛋白質翻譯后修飾過程,它在生物體的各項生命活動中起到至關重要的作用,如細胞間信號傳導和細胞內的生命過程(生長、分化、增殖、凋亡等)。在真核細胞中,用于編碼蛋白激酶的基因占總基因數(shù)的1-3%,而蛋白激酶的活性異�；蚴沁^表達與許多已知的疾病如炎癥、癌癥、糖尿病、老年癡呆癥等緊密相關。因此,通過測定特定激酶的活性不僅有益于推動基礎生命化學的研究進程,而且對于理解與激酶相關疾病機理有重要意義,并對生物診斷治療和抗增生藥物研發(fā)具有重要作用。傳統(tǒng)檢測蛋白激酶活性的方法主要是放射性方法和基于抗體-抗原特異性作用的免疫分析法,但這兩種方法存在著不足之處。其中放射性方法過程中涉及到對人類有害的放射性污染物,免疫分析方法的分析成本較高且缺少具有特異性識別的抗體。因此,新型激酶分析方法陸續(xù)被開發(fā)出來,如熒光方法、電化學方法、表面等離子體共振方法、質譜分析方法等。這些方法雖然各具一定的優(yōu)勢,但是也常常涉及到標記、孵育、清洗、檢測等多步過程,耗時耗力。因此發(fā)展高效通用的激酶分析方法對于分析工作者依然是一個挑戰(zhàn)。綜合上述考慮,本文基于毛細管在線富集技術的優(yōu)異富集性能和毛細管電泳分析方法的高自動化及高效分離能力,實現(xiàn)了對蛋白激酶活性及其對應的激酶抑制劑的高靈敏度檢測和篩選。主要內容如下：1、基于非連續(xù)電解質毛細管等速電泳技術(CITP)設計了一種在線間接檢測了蛋白激酶PKA活性的電泳分析方法平臺。毛細管等速電泳不僅具有較高的分析效能,而且常常作為一種在線富集手段用以提高毛細管電泳分析方法的靈敏度。由于PKA激酶催化產生的微量磷酸化多肽經由等速電泳技術在線富集之后被高效分離檢測,因此該方法的最低檢測限達到了12.5mU/μL,相較傳統(tǒng)的CZE的最低檢測限50 mU/μL降低了約4倍,大大提高了該方法分析激酶活性時的檢測靈敏度。由于該方法結合了電泳分析方法的自動化和程序化等優(yōu)點,所以在高通量分析激酶活性或篩選激酶特定抑制劑有著巨大的應用潛能。2、基于毛細管在線等電聚焦技術(on-line CIEF)在線富集磷酸化的多肽并高靈敏高效分析PKA蛋白激酶活性。毛細管等電聚焦不僅具有較高的分辨率,而且常常被用于作為一種高效富集手段用以提高毛細管電泳方法的靈敏度。在該方法中,分析PKA蛋白激酶活性時的最低檢測限為1.25mU/μL,較傳統(tǒng)CZE降低了約40倍,充分表明了on-line CIEF高靈敏度分析的特性。3、基于在線等電聚焦技術不僅具有較高的檢測靈敏度而且還具有較高的分離度,因此我們實現(xiàn)了多種激酶的同時分析及其抑制劑篩選并且檢測實際細胞裂解液中激酶的活性。其中對PKA和CDK1兩種激酶各自特異性抑制劑H-89、Ro-3306的抑制活性進行了評估,其IC5o值分別為37.0 nM、35.9 nM。實驗表明,on-line CIEF方法平臺不僅可以實現(xiàn)多種激酶活性的同時分析及其特定抑制劑的高效篩選,而且還可以用于檢測實際樣品細胞裂解液中PKA激酶的活性。
【關鍵詞】：毛細管在線富集技術 等電聚焦 等速電泳 蛋白激酶 激酶抑制劑 高通量篩選
【學位授予單位】：湖南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q55;O657.8
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第1章 緒論12-27
• 1.1 毛細管電泳技術概述12-13
• 1.2 毛細管電泳在線富集技術13-18
• 1.2.1 樣品堆積技術13-16
• 1.2.2 樣品掃集技術16
• 1.2.3 毛細管等速電泳技術16-17
• 1.2.4 毛細管等電聚焦17-18
• 1.2.5 在線固相富集技術18
• 1.3 蛋白質翻譯后修飾18-25
• 1.3.1 蛋白磷酸化修飾19-20
• 1.3.2 蛋白激酶活性檢測及其抑制劑篩選20
• 1.3.3 基于比色法檢測激酶活性20-22
• 1.3.4 基于熒光方法檢測激酶活性22-23
• 1.3.5 基于電化學檢測激酶活性23-24
• 1.3.6 基于毛細管電泳技術檢測激酶活性24-25
• 1.4 本文構思25-27
• 第2章 非連續(xù)電解質毛細管等速電泳在線富集磷酸化多肽間接檢測激酶活性27-35
• 2.1 前言27-28
• 2.2 實驗部分28-29
• 2.2.1 試劑與材料28-29
• 2.2.2 儀器29
• 2.2.3 CITP分析PKA催化的多肽底物和產物29
• 2.2.4 PKA激酶催化多肽磷酸化29
• 2.2.5 CITP檢測PKA激酶活性29
• 2.3 結果和討論29-34
• 2.3.1 CITP分析PKA多肽29-30
• 2.3.2 CITP條件優(yōu)化30-33
• 2.3.2.1 前導電解質體系中離子種類的優(yōu)化30-31
• 2.3.2.2 前導電解質濃度的優(yōu)化31-32
• 2.3.2.3 進樣時間條件優(yōu)化32
• 2.3.2.4 分離電壓條件優(yōu)化32-33
• 2.3.3 不同電泳方法檢測PKA多肽的比較33
• 2.3.4 激酶工作曲線的建立33-34
• 2.4 小結34-35
• 第3章 毛細管等電聚焦在線高靈敏度檢測PKA激酶活性35-43
• 3.1 前言35-36
• 3.2 實驗試劑、材料與儀器36-37
• 3.2.1 實驗試劑、材料36
• 3.2.2 實驗儀器36
• 3.2.3 毛細管等電聚焦用的中性毛細管的制備36-37
• 3.2.4 毛細管等電聚焦在線分析PKA催化的多肽底物和產物37
• 3.2.5 PKA激酶催化多肽磷酸化37
• 3.2.6 毛細管等電聚焦檢測PKA激酶活性37
• 3.3 結果和討論37-42
• 3.3.1 On-line CIEF分析PKA多肽37-38
• 3.3.2 條件優(yōu)化38-40
• 3.3.3 不同電泳方法檢測PKA多肽40-41
• 3.3.4 激酶工作曲線的建立41-42
• 3.4 小結42-43
• 第4章 在線等電聚焦同時分析多種激酶及其抑制劑篩選并高靈敏度檢測細胞裂解液中的激酶活性43-53
• 4.1 前言43-44
• 4.2 實驗部分44-46
• 4.2.1 試劑和材料44-45
• 4.2.2 實驗儀器設備45
• 4.2.3 毛細管在線等電聚焦結合激光誘導熒光檢測分析45
• 4.2.4 同時檢測激酶活性和激酶抑制劑篩選45
• 4.2.5 細胞裂解液中細胞激酶活性分析45-46
• 4.3 結果和討論46-51
• 4.3.1 在線等電聚焦富集分析雙重激酶催化多肽混合物46-47
• 4.3.2 雙重激酶活性檢測47-48
• 4.3.3 激酶抑制劑活性分析48-50
• 4.3.4 癌細胞裂解液中蛋白激酶活性檢測50-51
• 4.4 本章小結51-53
• 結論53-54
• 參考文獻54-62
• 附錄A 攻讀學位期間所發(fā)表的學術論文目錄62-63
• 致謝63

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本文編號：1059941