本文關(guān)鍵詞：CKIP-1敲除對抗微重力環(huán)境下小鼠骨質(zhì)疏松機理研究

  更多相關(guān)文章： 微重力 骨質(zhì)疏松 尾懸吊模型 CKIP-1敲除小鼠 BMSCs 成骨分化

【摘要】：研究背景和目的:微重力環(huán)境下,骨量發(fā)生丟失,骨密度下降,骨力學(xué)性能降低,呈現(xiàn)出明顯的骨質(zhì)疏松癥狀。為消除這種影響,通常采用的措施是體育鍛煉和藥物治療,但這些措施并不能徹底消除微重力對骨質(zhì)疏松的影響。隨著載人航天技術(shù)的發(fā)展,會有越來越多的宇航員進入太空,因此,尋找有效的對抗微重力環(huán)境下骨質(zhì)疏松的措施非常有意義。作為骨形成負(fù)調(diào)控因子,CKIP-1的敲除能夠?qū)е鹿敲芏群凸橇匡@著增加。因此,可以嘗試采取CKIP-1基因敲除的方法對抗微重力對骨代謝的影響。雖然空間飛行搭載實驗可以研究微重力對生物體的作用效應(yīng),但其局限性很大。所以,常用尾懸吊動物模型來模擬地面上的微重力。另外,負(fù)責(zé)骨形成的成骨細(xì)胞起源于BMSCs,在微重力環(huán)境下,BMSCs怎樣定向向成骨分化?它與CKIP-1的敲除能夠?qū)е鹿橇吭黾佑惺裁绰?lián)系?因此,我們利用RCCS模擬微重力環(huán)境,也對BMSCs的成骨分化進行了研究。本研究利用建立的小鼠尾懸吊模型,將WT小鼠和KO小鼠尾懸吊2w和4w后,比較不同組別小鼠的骨質(zhì)疏松癥狀,以期揭示微重力環(huán)境下CKIP-1對骨骼成骨化和破骨化平衡的影響,為微重力所致骨質(zhì)疏松的治療提供一個新的思路。另外,研究微重力環(huán)境下BMSCs的成骨分化,有助于進一步研究CKIP-1敲除對BMSCs成骨化的影響,可以全面揭示微重力環(huán)境下骨的重建過程。研究內(nèi)容與方法:(1)小鼠尾懸吊微重力模型的建立。參考大鼠尾懸吊模型,改進懸吊籠結(jié)構(gòu),優(yōu)化懸吊條件,建立小鼠尾懸吊微重力模型。選取2-3月齡C57BL/6J小鼠,雌雄隨機,利用醫(yī)用膠帶固定小鼠尾部,系于懸吊籠中進行尾部懸吊。調(diào)整高度,保證小鼠后肢離地,軀干與水平的角度約為30°,前肢能夠自由活動,能夠自由飲水和取食。選用與上述模型組相匹配的WT小鼠,正常條件下飼養(yǎng),作為對照組。比較不同組別小鼠血清鈣離子、ALP和BGP濃度;Micro-CT掃描其股骨,比較骨微結(jié)構(gòu)相關(guān)參數(shù)的變化;用材料試驗機對其股骨進行三點彎曲試驗,比較力學(xué)相關(guān)參數(shù)的變化。(2)微重力下CKIP-1敲除對小鼠骨質(zhì)疏松癥狀的影響。通過建立的小鼠尾懸吊模型,對WT小鼠和KO小鼠進行了2w和4w的尾懸吊實驗。分光光度法和ELISA法檢測了不同組別小鼠的血清ALP和BGP濃度變化;Micro-CT掃描其股骨的骨微結(jié)構(gòu),比較了BV/TV、Tb.Pf、Tb.Th、Tb.N和Tb.Sp等反映骨小梁微觀結(jié)構(gòu)的參數(shù);HE染色和免疫組化實驗比較其股骨切片形態(tài)的差異;三點彎曲試驗檢測其股骨力學(xué)性能的變化,比較了斷裂位移、斷裂應(yīng)變、斷裂載荷和斷裂能量等參數(shù);ELISA法檢測其血清成骨標(biāo)志物PⅠNF和破骨標(biāo)志物CTX-Ⅰ濃度的差異;RT-PCR和western blot比較其成骨相關(guān)基因和蛋白表達(dá)水平的差異。(3)微重力對小鼠BMSCs成骨分化的影響。采用密度梯度離心法,提取小鼠原代BMSCs,表面抗原細(xì)胞流式術(shù)鑒定其純度。在RCCS中模擬細(xì)胞培養(yǎng)微重力環(huán)境,加入成骨誘導(dǎo)劑培養(yǎng)14d,研究微重力環(huán)境下小鼠BMSCs成骨方向誘導(dǎo)的變化。分光光度法檢測其細(xì)胞培養(yǎng)上清液ALP濃度的變化,試劑盒比較其細(xì)胞ALP染色水平的差異,western blot檢測其成骨相關(guān)蛋白表達(dá)水平的改變。研究結(jié)果:(1)建立小鼠尾懸吊模擬微重力模型。與WT小鼠相比,TS小鼠血清中鈣離子濃度明顯升高、ALP和BGP濃度顯著降低;Micro-CT掃描結(jié)果證明其股骨的BV/TV下降、Tb.Pf上升、Tb.Th下降、Tb.N減少,而Tb.Sp上升;三點彎曲力學(xué)實驗也證明其股骨的斷裂位移、斷裂應(yīng)變、斷裂載荷和斷裂能量均發(fā)生降低。與WT小鼠相比,TS小鼠無論生化指標(biāo)、股骨微觀結(jié)構(gòu),還是股骨力學(xué)性能,均表現(xiàn)出明顯的骨質(zhì)疏松癥狀,證明我們所建立的微重力模型是成功的,為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。(2)研究微重力下CKIP-1敲除對小鼠骨質(zhì)疏松癥狀的影響。與未懸吊小鼠相比,懸吊組小鼠表現(xiàn)出明顯的骨質(zhì)疏松癥狀,無論是WT小鼠還是KO小鼠,并且骨質(zhì)疏松癥狀隨懸吊時間的延長而更加明顯,進一步證明我們的實驗?zāi)Ｐ褪浅晒Φ�。具體表現(xiàn)為懸吊組小鼠血清ALP和BGP濃度水平降低;股骨骨小梁顯微結(jié)構(gòu)退化,骨微結(jié)構(gòu)更加松散;股骨切片HE染色和BGP免疫組化實驗顯示其成骨化程度更弱;股骨力學(xué)性能下降;血清成骨標(biāo)志物PⅠNF濃度下降,但破骨標(biāo)志物CTX-Ⅰ濃度基本保持不變;成骨相關(guān)基因和蛋白BMP-2、Col-Ⅰ和Runx2的表達(dá)水平顯著下降。但在同等尾懸吊處理條件下,KO小鼠比WT小鼠血清ALP和BGP濃度更高;Micro-CT掃描表明其股骨BV/TV升高、Tb.Pf下降、Tb.Th升高、Tb.N升高,而Tb.Sp下降,骨微結(jié)構(gòu)更加致密;股骨切片HE染色和股骨BGP免疫組化實驗顯示其成骨化程度更強;三點彎曲試驗反映其力學(xué)性能的相關(guān)參數(shù)更高,表明其股骨力學(xué)性能更好;血清成骨標(biāo)志物PⅠNF濃度更高,但破骨標(biāo)志物CTX-Ⅰ濃度相差不明顯;成骨相關(guān)基因和蛋白BMP-2、Col-Ⅰ和Runx2的表達(dá)水平明顯增高。以上實驗結(jié)果表明,在同等處理條件下,與WT小鼠相比,KO小鼠的骨質(zhì)疏松癥狀較輕一些,充分證明了CKIP-1敲除對微重力的影響,說明CKIP-1敲除對微重力所導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松癥具有一定的對抗作用。同時也證明,CKIP-1只是影響新骨的形成,而對骨骼的吸收幾乎沒有影響。(3)研究微重力對小鼠BMSCs成骨分化的影響。在成骨誘導(dǎo)液的誘導(dǎo)下,BMSCs向成骨方向分化明顯。而在RCCS模擬微重力培養(yǎng)條件下,培養(yǎng)液中ALP濃度降低、BMSCs中ALP染色程度變淺、成骨相關(guān)蛋白BMP-2、BGP和Col-Ⅰ的表達(dá)程度降低,證明微重力環(huán)境下BMSCs成骨化程度降低,微重力可以抑制BMSCs向成骨方向分化,為進一步研究微重力環(huán)境下CKIP-1基因敲除和高表達(dá)對BMSCs成骨方向分化的影響提供了參考。結(jié)論:成功建立小鼠尾懸吊模擬微重力模型。同等尾懸吊條件下,多方面研究發(fā)現(xiàn)KO小鼠比WT小鼠表現(xiàn)出較輕的骨質(zhì)疏松癥狀,證明CKIP-1敲除可以部分對抗微重力對小鼠骨質(zhì)疏松的影響,為骨質(zhì)疏松的治療提供了一種新的思路。但這種影響只表現(xiàn)在成骨化過程,而對破骨化幾乎沒有抵消作用。此外,發(fā)現(xiàn)微重力可以影響小鼠BMSCs的成骨化,證明微重力的存在抑制了BMSCs向成骨方向的分化,為后續(xù)微重力下CKIP-1敲除和高表達(dá)對BMSCs成骨分化的研究奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：微重力 骨質(zhì)疏松 尾懸吊模型 CKIP-1敲除小鼠 BMSCs 成骨分化
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R85
【目錄】：

• 縮略詞表5-7
• 中文摘要7-10
• Abstract10-14
• 第一章 緒論14-29
• 1 研究背景14-18
• 2 研究目的與意義18
• 3 研究內(nèi)容與方法18-22
• 4 課題實施方案22-24
• 參考文獻(xiàn)24-29
• 第二章 小鼠微重力模型的建立29-39
• 1 材料與方法29-33
• 2 實驗結(jié)果33-34
• 3 討論34-36
• 本章小結(jié)36-37
• 參考文獻(xiàn)37-39
• 第三章 微重力下CKIP-1 敲除對小鼠骨質(zhì)疏松生化指標(biāo)和形態(tài)參數(shù)的影響39-52
• 1 材料與方法39-43
• 2 實驗結(jié)果43-47
• 3 討論47-49
• 本章小結(jié)49
• 參考文獻(xiàn)49-52
• 第四章 微重力下CKIP-1 敲除對小鼠骨質(zhì)疏松力學(xué)參數(shù)和分子指標(biāo)的影響52-64
• 1 材料與方法52-57
• 2 實驗結(jié)果57-61
• 3 討論61
• 本章小結(jié)61-62
• 參考文獻(xiàn)62-64
• 第五章 微重力對小鼠BMSCs成骨分化的影響64-77
• 1 材料與方法64-69
• 2 實驗結(jié)果69-73
• 3 討論73-74
• 本章小結(jié)74
• 參考文獻(xiàn)74-77
• 全文總結(jié)77-78
• 文獻(xiàn)綜述78-86
• 參考文獻(xiàn)82-86
• 代表性論著86-105
• 博士期間發(fā)表的文章105-107
• 個人簡歷107-108
• 致謝10

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