本文關(guān)鍵詞：模擬航天復(fù)合環(huán)境對(duì)大鼠精神行為相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

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【摘要】：隨著載人航天發(fā)展及空間站相關(guān)任務(wù)的持續(xù)推進(jìn),要求航天員在軌駐留的時(shí)間越來(lái)越長(zhǎng)。在長(zhǎng)期的太空飛行中,航天員由于所處的特殊環(huán)境,包括微重力、噪聲、生物節(jié)律改變和狹小空間等,都會(huì)對(duì)航天員的心理、生理等身心健康產(chǎn)生一定的影響,從而影響其工作能力的發(fā)揮。因此,為確保航天員在長(zhǎng)期空間飛行中健康、安全和高效的工作而開(kāi)展的相關(guān)研究已成為航天醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。目前,航天復(fù)合環(huán)境對(duì)航天員機(jī)體和腦功能影響的研究相對(duì)滯后。針對(duì)上述問(wèn)題以及未來(lái)航天發(fā)展的需求,從航天復(fù)合環(huán)境對(duì)精神行為影響的角度出發(fā),建立航天復(fù)合環(huán)境下大鼠模型,采用精神行為學(xué)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)、定量蛋白質(zhì)組學(xué)和質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)技術(shù),從蛋白整體水平研究并闡明航天復(fù)合環(huán)境對(duì)航天員腦功能的影響具有十分重要的意義。本研究通過(guò)模擬微重力環(huán)境和航天復(fù)合環(huán)境兩個(gè)層次的太空飛行環(huán)境,從行為學(xué)、海馬線粒體蛋白、海馬細(xì)胞膜蛋白和神經(jīng)遞質(zhì)等四個(gè)方面,對(duì)兩種環(huán)境下對(duì)大鼠海馬的影響進(jìn)行評(píng)價(jià),為探討太空復(fù)合環(huán)境對(duì)航天員的精神健康影響提供科學(xué)數(shù)據(jù)。本論文主要研究?jī)?nèi)容分為二個(gè)層面。一方面,建立單獨(dú)模擬微重力效應(yīng)的大鼠模型,監(jiān)測(cè)大鼠腦內(nèi)生理生化指標(biāo)的變化情況,并結(jié)合18O標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),鑒定模型組和對(duì)照組大鼠海馬細(xì)胞膜及線粒體的差異蛋白,探討模擬微重力效應(yīng)對(duì)大鼠精神行為影響的作用機(jī)制。另一方面,建立模擬航天復(fù)合環(huán)境(模擬微重力,噪聲,生物節(jié)律改變,狹小空間)多重因素影響的大鼠模型,探索該模型對(duì)大鼠精神行為的影響,利用18O標(biāo)記和非標(biāo)的“SWATH定量”蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),從蛋白水平揭示航天復(fù)合環(huán)境對(duì)大鼠海馬腦區(qū)的影響。綜合兩個(gè)層次的工作,本研究取得了以下幾個(gè)成果:1成功建立了中長(zhǎng)期模擬微重力效應(yīng)的大鼠模型并進(jìn)行了模型評(píng)價(jià)。采用大鼠吊尾21天模型模擬中長(zhǎng)期微重力效應(yīng),通過(guò)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行日均攝食、體重和行為學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)模擬中長(zhǎng)期微重力下模型組大鼠的日均攝食和體重較正常組分別變化0.51%和0.75%,可以真實(shí)地模擬微重力效應(yīng),提示模型構(gòu)建成功。在糖水實(shí)驗(yàn)中模擬微重力組糖水偏愛(ài)率與對(duì)照組無(wú)顯著性差異(p0.05),強(qiáng)迫游泳靜止飄浮時(shí)間無(wú)顯著性差異(p0.05),而模擬跨格次數(shù)和直立次數(shù)顯著低于對(duì)照組(p0.05)。中央格停留時(shí)間明顯減少(p0.05),自我修飾和糞便顆粒明顯增多(p0.05),表明模擬微重力21天使大鼠產(chǎn)生一定程度的焦慮。吊尾21天大鼠海馬的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛(malondialdehyde,mda)和過(guò)氧化氫(h2o2)含量與正常組相比明顯升高,而超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,sod)的含量與正常組相比明顯降低(p0.05),表明中長(zhǎng)期模擬微重力效應(yīng)下大鼠海馬出現(xiàn)了氧化應(yīng)激。因此,可以大鼠的平均日攝食、體重和氧化應(yīng)激的指標(biāo)變化進(jìn)行中長(zhǎng)期模擬微重力的模型評(píng)價(jià)。2從蛋白層面上進(jìn)一步確證了中長(zhǎng)期模擬微重力效應(yīng)產(chǎn)生氧化應(yīng)激的損傷并使能量代謝發(fā)生紊亂。采用18o標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析大鼠海馬線粒體蛋白的變化,當(dāng)肽段假陽(yáng)性率fdr1%,肽段得分spi=15時(shí),共鑒定到679個(gè)蛋白,其中差異蛋白42個(gè),上調(diào)21個(gè),下調(diào)21個(gè)。這些差異蛋白主要富集在(1)氧化磷酸化過(guò)程受損(線粒體復(fù)合體i、iii和iv的蛋白表達(dá)下調(diào));(2)三羧酸循環(huán)(tca)催化過(guò)程受損(異檸檬酸脫氫酶和蘋(píng)果酸脫氫酶表達(dá)下調(diào));(3)脂肪酸的氧化紊亂(長(zhǎng)鏈脂肪酸輔酶a連接蛋白亞基6表達(dá)上調(diào)、極長(zhǎng)鏈乙酰輔酶a脫氫酶、乙酰輔酶a合成酶家族蛋白2和脂肪酸酰胺水解酶表達(dá)下調(diào))。部分蛋白在已有的微重力研究中未被報(bào)道過(guò)。同時(shí)抗氧化蛋白dj-1和過(guò)氧化物氧化還原酶6表達(dá)上調(diào),可能與細(xì)胞內(nèi)的代償效應(yīng)相關(guān)。westernblot驗(yàn)證了dj-1和cox5a的表達(dá),與質(zhì)譜結(jié)果一致。3模擬微重力影響了大鼠海馬神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和清除,興奮性遞質(zhì)谷氨酸濃度過(guò)度升高,抑制性遞質(zhì)r-氨基丁酸合成減弱,可能對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生一定的毒性損傷。采用18o標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組分析了大鼠海馬細(xì)胞膜蛋白的變化,當(dāng)肽段fdr1%,spi=15時(shí),共鑒定到863個(gè)蛋白,其中差異蛋白53個(gè),上調(diào)31個(gè),下調(diào)22個(gè)。這些差異蛋白主要富集在(1)snare復(fù)合體形成受到干擾(囊泡相關(guān)膜蛋白3和突觸融合蛋白-1a表達(dá)下調(diào));(2)突觸囊泡回收受到影響(突觸融合蛋白-結(jié)合蛋白5和小g蛋白rab3a表達(dá)下調(diào),效應(yīng)分子rim2表達(dá)上調(diào));(3)突觸間隙的谷氨酸清除受到影響(神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的谷氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)體1表達(dá)下調(diào),囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1和2表達(dá)上調(diào));(4)氨基丁酸合成受到影響(谷氨酸脫羧酶1和谷氨酸脫羧酶2表達(dá)下調(diào))。蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果提示谷氨酸的清除和r-氨基丁酸的合成受到影響。而興奮性谷氨酸過(guò)度增加和抑制性r-氨基丁酸過(guò)度減弱均會(huì)給神經(jīng)元造成損傷。同時(shí),以質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiplereactionmonitoring,mrm)的方法分析了腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)中長(zhǎng)期微重力組大鼠海馬興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸濃度101.60μg/mg較正常組85.29μg/mg明顯升高(p0.05),而抑制性神經(jīng)遞質(zhì)r-氨基丁酸27.69μg/mg與正常組37.64μg/mg相比明顯下降(p0.05),這一結(jié)果和谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體和谷氨酸脫羧酶的變化趨勢(shì)一致,進(jìn)一步證實(shí)模擬微重力影響了大鼠海馬神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和清除過(guò)程。westernblot驗(yàn)證了psd-95的表達(dá),與質(zhì)譜結(jié)果一致。4成功建立了模擬航天復(fù)合環(huán)境的大鼠模型并進(jìn)行了模型評(píng)價(jià)。在21天吊尾模型的基礎(chǔ)上復(fù)合噪聲(65db),生物節(jié)律改變(1.5h)及狹小空間三個(gè)因素模擬航天員長(zhǎng)期航天飛行中所處的復(fù)雜艙室環(huán)境,對(duì)動(dòng)物進(jìn)行日均攝食、體重和行為學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)模擬航天復(fù)合環(huán)境下模型組大鼠的日均攝食量與對(duì)照組相比減少4.2%,體重與對(duì)照組相比減少5.9%。模擬航天復(fù)合環(huán)境下模型組大鼠在糖水實(shí)驗(yàn)中其糖水偏愛(ài)率與對(duì)照組相比明顯降低(p0.05),強(qiáng)迫游泳靜止飄浮時(shí)間顯著減少(p0.05),模型組動(dòng)物在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中跨格次數(shù)與直立次數(shù)也明顯減少(p0.05),中央停留的時(shí)間也明顯低于對(duì)照組(p0.05),而自我修飾和糞便顆粒數(shù)明顯高于對(duì)照組(p0.05),表明模擬航天復(fù)合環(huán)境下大鼠情緒出現(xiàn)了抑郁樣改變。5模擬航天復(fù)合環(huán)境下大鼠海馬線粒體能量代謝出現(xiàn)紊亂。采用18o標(biāo)記的差異蛋白質(zhì)組學(xué),對(duì)模擬航天復(fù)合環(huán)境模型大鼠海馬線粒體進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析,結(jié)果顯示當(dāng)肽段fdr1%,spi=15時(shí),共鑒定到515個(gè)蛋白,其中差異蛋白89個(gè),12個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào),77個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)。發(fā)現(xiàn)這些差異蛋白主要富集在氧化磷酸化(線粒體復(fù)合體i、iii和v的蛋白均表達(dá)下調(diào))和三羧酸循環(huán)(丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的亞基和烏頭酸水合酶表達(dá)下調(diào))的生物學(xué)過(guò)程。6模擬航天復(fù)合環(huán)境影響了大鼠海馬的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工、突觸的囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)和神經(jīng)突觸傳遞過(guò)程,興奮性遞質(zhì)谷氨酸濃度增加,抑制性遞質(zhì)r-氨基丁酸減少,可能對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生一定的毒性損傷。采用非標(biāo)的swath定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法,對(duì)模擬航天復(fù)合環(huán)境大鼠模型中海馬細(xì)胞膜蛋白進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析。當(dāng)肽段1%fdr時(shí),共鑒定到4520個(gè)定量蛋白。其中差異蛋白1112個(gè)蛋白,812個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào),300個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)。發(fā)現(xiàn)模擬航天復(fù)合環(huán)境影響了與sec61、sec62等蛋白相關(guān)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工過(guò)程,與ap180、ap2激酶、dynamin-1、clathrin-lightchain等蛋白相關(guān)的突觸的囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)和與psd-95、neurexin2、neuroligin-1等蛋白相關(guān)的神經(jīng)突觸傳遞過(guò)程。通過(guò)質(zhì)譜mrm方法發(fā)現(xiàn)模擬航天環(huán)境組大鼠海馬興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸濃度154.38μg/mg較正常組85.68μg/mg明顯升高(p0.05),而抑制性神經(jīng)遞質(zhì)r-氨基丁酸15.42μg/mg與正常組36.44μg/mg相比明顯下降(p0.05)。這些變化均提示模擬航天復(fù)合環(huán)境可能會(huì)對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元產(chǎn)生一定的損傷。westernblot驗(yàn)證了gsk-3的表達(dá),與質(zhì)譜結(jié)果一致。7模擬航天復(fù)合環(huán)境對(duì)大鼠腦神經(jīng)的影響較單獨(dú)模擬微重力的環(huán)境相比,影響更為嚴(yán)重。從行為學(xué)、海馬線粒體蛋白、海馬細(xì)胞膜蛋白和神經(jīng)遞質(zhì)等四個(gè)方面對(duì)以上兩種環(huán)境下大鼠的精神行為進(jìn)行評(píng)價(jià),發(fā)現(xiàn)航天復(fù)合環(huán)境對(duì)大鼠海馬的影響更為嚴(yán)重。綜上所述,本研究針對(duì)載人航天發(fā)展的未來(lái)需求,以提升航天員的適應(yīng)能力、決策能力為目標(biāo),通過(guò)模擬兩個(gè)層次的太空飛行環(huán)境,即單獨(dú)模擬微重力環(huán)境和航天復(fù)合環(huán)境,建立了模擬航天復(fù)合環(huán)境對(duì)精神行為復(fù)合因素影響的動(dòng)物模型,并結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)技術(shù),探尋航天復(fù)合環(huán)境對(duì)人的精神行為影響的重要分子機(jī)制,為未來(lái)航天復(fù)合環(huán)境設(shè)計(jì),改善航天員保護(hù)措施提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。這項(xiàng)研究同時(shí)也對(duì)地球上精神類疾病發(fā)病機(jī)制的探討具有重要意義。
【關(guān)鍵詞】：模擬微重力 模擬航天復(fù)合環(huán)境 海馬 比較蛋白質(zhì)組學(xué) 線粒體 膜蛋白
【學(xué)位授予單位】：北京理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R85
【目錄】：

• 摘要4-8
• Abstract8-13
• 縮略詞表13-19
• 第1章 緒論19-33
• 1.1 空間站環(huán)境概述19-20
• 1.2 空間環(huán)境因素對(duì)精神行為的影響20-22
• 1.2.1 噪聲和焦慮抑郁密切相關(guān)20
• 1.2.2 狹小空間和焦慮抑郁密閉相關(guān)20-21
• 1.2.3 生物節(jié)律改變和抑郁密切相關(guān)21
• 1.2.4 微重力和焦慮密切相關(guān)21-22
• 1.3 微重力的生物效應(yīng)學(xué)研究現(xiàn)狀22-26
• 1.3.1 研究微重力的模型22-23
• 1.3.2 微重力對(duì)生物機(jī)體的影響及作用機(jī)制的探討23-26
• 1.4 蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展及其在空間環(huán)境研究中的應(yīng)用26-31
• 1.4.1 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)展26-29
• 1.4.2 蛋白質(zhì)組學(xué)在空間環(huán)境研究中的應(yīng)用29-31
• 1.5 課題研究基礎(chǔ)與思路31-33
• 1.5.1 研究基礎(chǔ)31
• 1.5.2 課題思路31-33
• 第2章 實(shí)驗(yàn)部分33-53
• 2.1 實(shí)驗(yàn)儀器33
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料33-38
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物33-34
• 2.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑34-36
• 2.2.3 溶液配制36-38
• 2.2.4 一抗38
• 2.3 動(dòng)物模型的建立38-40
• 2.3.1 模擬微重力模型38-39
• 2.3.2 模擬航天復(fù)合環(huán)境大鼠模型39
• 2.3.3 模擬航天復(fù)合模型箱39-40
• 2.4 行為學(xué)檢測(cè)40-42
• 2.4.1 攝食和體重40
• 2.4.2 糖水偏愛(ài)實(shí)驗(yàn)40-41
• 2.4.3 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)41
• 2.4.4 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)41
• 2.4.5 鼠腦的取材41-42
• 2.4.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)42
• 2.5 氧化應(yīng)激水平的測(cè)定42-44
• 2.5.1 蛋白濃度測(cè)定42
• 2.5.2 丙二醛（MDA）含量測(cè)定42-43
• 2.5.3 過(guò)氧化氫（H_2O_2）含量測(cè)定43
• 2.5.4 超氧化物歧化酶SOD含量測(cè)定43-44
• 2.6 神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸和r-氨基丁酸的含量測(cè)定44-45
• 2.6.1 谷氨酸 (Glu)，r-氨基丁酸（GABA）標(biāo)準(zhǔn)品的配制44
• 2.6.2 大鼠海馬樣品的制備44
• 2.6.3 液相色譜條件44
• 2.6.4 質(zhì)譜條件44-45
• 2.6.5 數(shù)據(jù)處理45
• 2.6.6 含量測(cè)定45
• 2.7 ~(18)O差異蛋白質(zhì)組學(xué)45-49
• 2.7.1 大鼠海馬線粒體蛋白的提取45
• 2.7.2 大鼠海馬細(xì)胞膜蛋白的提取45-46
• 2.7.3 大鼠海馬線粒體蛋白的免疫印跡（western blot）驗(yàn)證46-47
• 2.7.4 大鼠海馬蛋白酶解47
• 2.7.5 大鼠海馬蛋白~(18)O標(biāo)記47
• 2.7.6 固相萃取（SPE）脫鹽47-48
• 2.7.7 強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜（SCX）分離48
• 2.7.8 納升級(jí)反相液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析48-49
• 2.7.9 數(shù)據(jù)分析49
• 2.7.10 Western blot驗(yàn)證49
• 2.8 基于非標(biāo)的全景式數(shù)據(jù)采集的質(zhì)譜SWATH定量49-53
• 2.8.1 大鼠海馬細(xì)胞膜蛋白的提取49
• 2.8.2 基于超濾輔助樣品酶解49-50
• 2.8.3 一維的高pH反相液相色譜分離50
• 2.8.4 SWATH定量50-52
• 2.8.5 數(shù)據(jù)分析52
• 2.8.6 Western blot驗(yàn)證52-53
• 第3章 結(jié)果與討論53-120
• 3.1 模擬微重力下大鼠模型的評(píng)價(jià)53-58
• 3.1.1 模擬微重力下大鼠的攝食和體重評(píng)價(jià)53-54
• 3.1.2 模擬微重力效應(yīng)下大鼠行為學(xué)評(píng)價(jià)54-56
• 3.1.4 中長(zhǎng)期模擬微重力效應(yīng)對(duì)海馬氧化應(yīng)激水平的影響56-58
• 3.2 模擬微重力下對(duì)大鼠海馬線粒體蛋白的影響58-79
• 3.2.1 7天模擬微重力對(duì)大鼠海馬線粒體的蛋白質(zhì)組學(xué)研究58-64
• 3.2.2 21天模擬微重力對(duì)大鼠海馬線粒體的蛋白質(zhì)組學(xué)研究64-69
• 3.2.3 7天和21天模擬微重力下大鼠海馬線粒體蛋白的比較69-79
• 3.3 模擬微重力對(duì)大鼠海馬膜蛋白影響79-89
• 3.3.1 21天模擬微重力下大鼠海馬膜蛋白組學(xué)研究79-87
• 3.3.2 21天模擬微重力對(duì)大鼠海馬谷氨酸及r-氨基丁酸的影響87-89
• 3.4 模擬航天復(fù)合環(huán)境下大鼠模型的評(píng)價(jià)89-94
• 3.4.1 模擬航天復(fù)合環(huán)境下對(duì)大鼠平均攝食和體重的影響90
• 3.4.2 模擬航天復(fù)合環(huán)境下大鼠行為學(xué)評(píng)價(jià)90-94
• 3.5 模擬航天復(fù)合環(huán)境下大鼠海馬線粒體蛋白質(zhì)的影響94-101
• 3.6 模擬航天復(fù)合環(huán)境下大鼠海馬細(xì)胞膜蛋白的影響101-117
• 3.7 模擬航天復(fù)合環(huán)境與模擬微重力對(duì)大鼠海馬蛋白的比較117-120
• 3.7.1 兩種環(huán)境對(duì)行為學(xué)的影響117
• 3.7.2 兩種環(huán)境對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)的影響117-118
• 3.7.3 兩種環(huán)境對(duì)海馬線粒體蛋白的影響118
• 3.7.4 兩種環(huán)境對(duì)海馬細(xì)胞膜蛋白的影響118-120
• 結(jié)論120-123
• 參考文獻(xiàn)123-133
• 附錄133-149
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文與研究成果清單149-151
• 致謝151-152

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5 王鶴濱;大鼠血漿蛋白組成部分比值與輻射感受性的關(guān)系——Ⅰ正常大鼠與“恢復(fù)大鼠”[J];核防護(hù);1977年Z2期

6 王鶴濱;大鼠血漿蛋白組成部分比值與輻射感受性的關(guān)系——Ⅱ不同品種、性別、年齡的大鼠[J];核防護(hù);1977年Z2期

7 尹金玲;滿其航;崔玉芳;杜麗;馬瓊;;微波輻照誘發(fā)Wistar大鼠外周血淋巴細(xì)胞亞群變化[J];輻射防護(hù)通訊;2011年04期

8 古桂雄,朱壽彭,王六一,楊淑琴,朱玲俐;濃縮鈾對(duì)新生大鼠發(fā)育腦損傷的影響[J];中國(guó)核科技報(bào)告;2000年00期

9 丁建松;聶繼華;童建;;蜂膠對(duì)氡及其子體吸入致大鼠損傷的防護(hù)作用研究[J];輻射研究與輻射工藝學(xué)報(bào);2006年05期

10 劉廣興;崔猛;劉振國(guó);牛銀波;王婷梅;梅其炳;;無(wú)創(chuàng)尾吊大鼠心血管功能監(jiān)測(cè)新方法[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2009年22期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 尹音;孫振宇;胡敏;李冬霞;;持續(xù)性高正加速度對(duì)大鼠顳頜關(guān)節(jié)損傷的作用[A];第八屆全國(guó)顳下頜關(guān)節(jié)病學(xué)及（牙合）學(xué)大會(huì)論文匯編[C];2011年

2 祝~=驤;iJ梊霞;洃克琴;崔素英;文允摪;，

本文編號(hào)：597210