本文關鍵詞：miRNA-132-3p對大鼠成骨細胞功能的抑制作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：對于保持在地面正常重力環(huán)境下建立起來的機體內環(huán)境的穩(wěn)態(tài)平衡而言，長期航天飛行將是一個嚴峻的挑戰(zhàn)。在航天飛行中，失重環(huán)境引起的機體內環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡常會誘發(fā)多個系統(tǒng)的功能改變，主要包括心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經系統(tǒng)等生理系統(tǒng)的適應性功能改變以及骨骼系統(tǒng)、肌肉系統(tǒng)的長期持續(xù)性功能變化。數(shù)百萬年來，人體骨骼系統(tǒng)的動態(tài)重建過程已經適應了正常重力環(huán)境的影響，且對于重力環(huán)境的變化極為敏感。失重環(huán)境打破了骨重建過程中骨形成與骨吸收之間的平衡，使得骨吸收多于骨形成，導致承重骨發(fā)生持續(xù)性骨質丟失，而且這種骨質丟失沒有自限性，隨著暴露時間的延長呈逐漸加重趨勢，嚴重影響著航天員的健康。 目前，失重性骨質丟失的機制尚不明確，已有的實驗結果提示失重性骨質丟失的主要原因是成骨細胞功能下降。作為骨形成過程中的主要功能細胞，成骨細胞在分化過程中受到多種轉錄因子調控，miRNA就是其中一種重要的基因轉錄后調控因子。miRNA是一種22個核苷酸左右的單鏈非編碼小RNA，它可以通過精細調控基因表達而廣泛參與到細胞的各種生物學過程中去。目前，已有多種miRNA被確認在成骨細胞分化和骨骼形成中起到重要的調控作用。但是，在失重性骨質丟失研究領域，卻鮮見相關miRNA研究報道。 本課題組采用尾吊大鼠模型模擬失重生物效應，利用芯片技術檢測尾吊組與對照組之間股骨miRNA的差異表達情況，選出差異表達顯著的miRNA進行細胞學驗證，然后通過細胞內過表達或者降低目標miRNA表達來研究其對成骨細胞功能的影響及其所參與的信號通路。本研究的主要發(fā)現(xiàn)和結果如下： 1.模擬失重導致股骨組織miRNA表達譜改變。我們將3月齡SD雄性大鼠尾部懸吊3周后，使用“Agilet大鼠小RNA芯片”對提取的股骨總RNA進行檢測，共篩選出26種差異表達顯著的miRNA，其中14種miRNA表達降低，12種miRNA表達升高。然后對差異倍數(shù)在兩倍以上的miRNA進行了q RT-PCR驗證，結果顯示，包括miRNA-132-3p、miRNA-139-3p、miRNA-2985、miRNA-487b、miRNA-339-3p、miRNA-33等在內的多種miRNA的表達趨勢與芯片結果一致，這為我們尋找模擬失重下參與調控成骨細胞功能變化的miRNA提供了篩選范圍。進一步在2D回轉器模擬失重條件下培養(yǎng)的大鼠原代成骨細胞上進行驗證，應用q RT-PCR檢測上述候選miRNA的表達變化，其中miRNA-132-3p表現(xiàn)為先升高后回落的變化趨勢：回轉24h后表達升高1.46倍，回轉48h后升高2.11倍，回轉72h后回落至1.25倍，回轉96h后趨于正常；其變化特點與動物學實驗結果相符。實驗結果表明模擬失重可以導致大鼠股骨組織相關細胞的miRNA表達譜發(fā)生變化，而miRNA-132-3p可能與模擬失重導致的成骨細胞功能抑制存在一定關系。 2. miRNA-132-3p抑制成骨細胞的增殖、分化和礦化能力。向大鼠原代成骨細胞內轉染miRNA-132-3p的mimic和inhibitor及其相應的陰性對照N.C.，實現(xiàn)細胞內miRNA-132-3p的過表達和降低表達，研究其對成骨細胞功能的影響。分別應用CCK-8法、q RT-PCR、Western blotting、ALP底物顯色反應以及茜素紅鈣化結節(jié)染色等方法來評價轉染后成骨細胞功能變化，結果顯示，轉染miRNA-132-3p mimic組的細胞數(shù)量與正常對照組和N.C.對照組相比均顯著下降，成骨細胞特異性分化標志物和特異性轉錄因子ALP、Runx2和Osx的表達水平顯著降低，ALP活性下降約30%；礦化結節(jié)數(shù)量明顯減少。而轉染inhibitor后所得結果與轉染mimic后結果相反，進一步驗證了miRNA-132-3p對成骨細胞的調控作用。本實驗結果提示miRNA-132-3p可以抑制成骨細胞的增殖、分化和礦化能力。 3. miRNA-132-3p通過抑制EP300的表達而參與成骨細胞分化調控。miRNA通過與靶基因3’UTR的靶點結合而抑制靶基因的蛋白翻譯，進而調控細胞生物學過程。我們應用TargetScan和PITA兩種常用靶基因預測軟件預測miRNA-132-3p的靶基因，取兩者預測結果的交集作為候選靶基因進行后續(xù)驗證。預測顯示BTG2、COLQ、EP300、PXN、SOX4、TIMM9、HMGA2、ID2等數(shù)十種基因的3’UTR存在miRNA-132-3p的潛在結合靶點，結合成骨細胞功能，我們選定SOX4、EP300、TIMM9和ID2四個潛在靶基因進行雙熒光素酶報告基因實驗驗證，結果證實EP300和TIMM9是miRNA-132-3p的作用靶基因。結合文獻報道，我們重點對EP300進行了深入研究：轉染miRNA-132-3p的mimic之后，大鼠原代成骨細胞內的EP300的mRNA轉錄沒有出現(xiàn)明顯變化，但是蛋白表達卻顯著降低，這與模擬失重條件下，成骨細胞中EP300的蛋白表達變化一致。而應用siRNA技術沉默大鼠原代成骨細胞中EP300的表達，可以抑制成骨細胞的分化過程，說明miRNA-132-3p可能通過抑制EP300的蛋白翻譯而抑制成骨細胞的分化。 綜上所述，，我們研究了模擬失重條件下大鼠股骨組織miRNA的表達變化，首次發(fā)現(xiàn)miRNA-132-3p可以調控成骨細胞的功能。miRNA-132-3p可通過阻礙EP300的蛋白表達而降低EP300與Runx2的協(xié)同調控作用，抑制成骨細胞的分化過程。miRNA-132-3p參與模擬失重條件下成骨細胞功能變化的調控，這為進一步闡明失重性骨質丟失的細胞學機制提供了實驗支持。
【關鍵詞】：模擬失重 尾部懸吊大鼠模型 成骨細胞 miRNA
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R852.22
【目錄】：

• 縮略語表4-9
• 中文摘要9-12
• 英文摘要12-16
• 前言16-18
• 文獻回顧18-31
• 第一部分 模擬失重條件下大鼠股骨組織 miRNA 表達譜分析31-47
• 1 材料31-34
• 2 方法34-39
• 3 結果39-44
• 4 討論44-47
• 第二部分 miRNA-132-3p 對成骨細胞生物學效應影響的研究47-61
• 1 材料47-49
• 2 方法49-54
• 3 結果54-59
• 4 討論59-61
• 第三部分 miRNA-132-3p調控成骨細胞功能的作用機制的研究61-74
• 1 材料61-63
• 2 方法63-67
• 3 結果67-72
• 4 討論72-74
• 小結74-76
• 參考文獻76-82
• 個人簡歷和研究成果82-83
• 致謝83-84

【共引文獻】

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  本文關鍵詞：miRNA-132-3p對大鼠成骨細胞功能的抑制作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：265211