本文關(guān)鍵詞：miRNA-132-3p對(duì)大鼠成骨細(xì)胞功能的抑制作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：對(duì)于保持在地面正常重力環(huán)境下建立起來(lái)的機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)平衡而言，長(zhǎng)期航天飛行將是一個(gè)嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。在航天飛行中，失重環(huán)境引起的機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡常會(huì)誘發(fā)多個(gè)系統(tǒng)的功能改變，主要包括心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等生理系統(tǒng)的適應(yīng)性功能改變以及骨骼系統(tǒng)、肌肉系統(tǒng)的長(zhǎng)期持續(xù)性功能變化。數(shù)百萬(wàn)年來(lái)，人體骨骼系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)重建過(guò)程已經(jīng)適應(yīng)了正常重力環(huán)境的影響，且對(duì)于重力環(huán)境的變化極為敏感。失重環(huán)境打破了骨重建過(guò)程中骨形成與骨吸收之間的平衡，使得骨吸收多于骨形成，導(dǎo)致承重骨發(fā)生持續(xù)性骨質(zhì)丟失，而且這種骨質(zhì)丟失沒(méi)有自限性，隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)呈逐漸加重趨勢(shì)，嚴(yán)重影響著航天員的健康。 目前，失重性骨質(zhì)丟失的機(jī)制尚不明確，已有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示失重性骨質(zhì)丟失的主要原因是成骨細(xì)胞功能下降。作為骨形成過(guò)程中的主要功能細(xì)胞，成骨細(xì)胞在分化過(guò)程中受到多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，miRNA就是其中一種重要的基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子。miRNA是一種22個(gè)核苷酸左右的單鏈非編碼小RNA，它可以通過(guò)精細(xì)調(diào)控基因表達(dá)而廣泛參與到細(xì)胞的各種生物學(xué)過(guò)程中去。目前，已有多種miRNA被確認(rèn)在成骨細(xì)胞分化和骨骼形成中起到重要的調(diào)控作用。但是，在失重性骨質(zhì)丟失研究領(lǐng)域，卻鮮見(jiàn)相關(guān)miRNA研究報(bào)道。 本課題組采用尾吊大鼠模型模擬失重生物效應(yīng)，利用芯片技術(shù)檢測(cè)尾吊組與對(duì)照組之間股骨miRNA的差異表達(dá)情況，選出差異表達(dá)顯著的miRNA進(jìn)行細(xì)胞學(xué)驗(yàn)證，然后通過(guò)細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)或者降低目標(biāo)miRNA表達(dá)來(lái)研究其對(duì)成骨細(xì)胞功能的影響及其所參與的信號(hào)通路。本研究的主要發(fā)現(xiàn)和結(jié)果如下： 1.模擬失重導(dǎo)致股骨組織miRNA表達(dá)譜改變。我們將3月齡SD雄性大鼠尾部懸吊3周后，使用“Agilet大鼠小RNA芯片”對(duì)提取的股骨總RNA進(jìn)行檢測(cè)，共篩選出26種差異表達(dá)顯著的miRNA，其中14種miRNA表達(dá)降低，12種miRNA表達(dá)升高。然后對(duì)差異倍數(shù)在兩倍以上的miRNA進(jìn)行了q RT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示，包括miRNA-132-3p、miRNA-139-3p、miRNA-2985、miRNA-487b、miRNA-339-3p、miRNA-33等在內(nèi)的多種miRNA的表達(dá)趨勢(shì)與芯片結(jié)果一致，這為我們尋找模擬失重下參與調(diào)控成骨細(xì)胞功能變化的miRNA提供了篩選范圍。進(jìn)一步在2D回轉(zhuǎn)器模擬失重條件下培養(yǎng)的大鼠原代成骨細(xì)胞上進(jìn)行驗(yàn)證，應(yīng)用q RT-PCR檢測(cè)上述候選miRNA的表達(dá)變化，其中miRNA-132-3p表現(xiàn)為先升高后回落的變化趨勢(shì)：回轉(zhuǎn)24h后表達(dá)升高1.46倍，回轉(zhuǎn)48h后升高2.11倍，回轉(zhuǎn)72h后回落至1.25倍，回轉(zhuǎn)96h后趨于正常；其變化特點(diǎn)與動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明模擬失重可以導(dǎo)致大鼠股骨組織相關(guān)細(xì)胞的miRNA表達(dá)譜發(fā)生變化，而miRNA-132-3p可能與模擬失重導(dǎo)致的成骨細(xì)胞功能抑制存在一定關(guān)系。 2. miRNA-132-3p抑制成骨細(xì)胞的增殖、分化和礦化能力。向大鼠原代成骨細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染miRNA-132-3p的mimic和inhibitor及其相應(yīng)的陰性對(duì)照N.C.，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)miRNA-132-3p的過(guò)表達(dá)和降低表達(dá)，研究其對(duì)成骨細(xì)胞功能的影響。分別應(yīng)用CCK-8法、q RT-PCR、Western blotting、ALP底物顯色反應(yīng)以及茜素紅鈣化結(jié)節(jié)染色等方法來(lái)評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染后成骨細(xì)胞功能變化，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miRNA-132-3p mimic組的細(xì)胞數(shù)量與正常對(duì)照組和N.C.對(duì)照組相比均顯著下降，成骨細(xì)胞特異性分化標(biāo)志物和特異性轉(zhuǎn)錄因子ALP、Runx2和Osx的表達(dá)水平顯著降低，ALP活性下降約30%；礦化結(jié)節(jié)數(shù)量明顯減少。而轉(zhuǎn)染inhibitor后所得結(jié)果與轉(zhuǎn)染mimic后結(jié)果相反，進(jìn)一步驗(yàn)證了miRNA-132-3p對(duì)成骨細(xì)胞的調(diào)控作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示miRNA-132-3p可以抑制成骨細(xì)胞的增殖、分化和礦化能力。 3. miRNA-132-3p通過(guò)抑制EP300的表達(dá)而參與成骨細(xì)胞分化調(diào)控。miRNA通過(guò)與靶基因3’UTR的靶點(diǎn)結(jié)合而抑制靶基因的蛋白翻譯，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程。我們應(yīng)用TargetScan和PITA兩種常用靶基因預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)miRNA-132-3p的靶基因，取兩者預(yù)測(cè)結(jié)果的交集作為候選靶基因進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證。預(yù)測(cè)顯示BTG2、COLQ、EP300、PXN、SOX4、TIMM9、HMGA2、ID2等數(shù)十種基因的3’UTR存在miRNA-132-3p的潛在結(jié)合靶點(diǎn)，結(jié)合成骨細(xì)胞功能，我們選定SOX4、EP300、TIMM9和ID2四個(gè)潛在靶基因進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證，結(jié)果證實(shí)EP300和TIMM9是miRNA-132-3p的作用靶基因。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，我們重點(diǎn)對(duì)EP300進(jìn)行了深入研究：轉(zhuǎn)染miRNA-132-3p的mimic之后，大鼠原代成骨細(xì)胞內(nèi)的EP300的mRNA轉(zhuǎn)錄沒(méi)有出現(xiàn)明顯變化，但是蛋白表達(dá)卻顯著降低，這與模擬失重條件下，成骨細(xì)胞中EP300的蛋白表達(dá)變化一致。而應(yīng)用siRNA技術(shù)沉默大鼠原代成骨細(xì)胞中EP300的表達(dá)，可以抑制成骨細(xì)胞的分化過(guò)程，說(shuō)明miRNA-132-3p可能通過(guò)抑制EP300的蛋白翻譯而抑制成骨細(xì)胞的分化。 綜上所述，，我們研究了模擬失重條件下大鼠股骨組織miRNA的表達(dá)變化，首次發(fā)現(xiàn)miRNA-132-3p可以調(diào)控成骨細(xì)胞的功能。miRNA-132-3p可通過(guò)阻礙EP300的蛋白表達(dá)而降低EP300與Runx2的協(xié)同調(diào)控作用，抑制成骨細(xì)胞的分化過(guò)程。miRNA-132-3p參與模擬失重條件下成骨細(xì)胞功能變化的調(diào)控，這為進(jìn)一步闡明失重性骨質(zhì)丟失的細(xì)胞學(xué)機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)支持。
【關(guān)鍵詞】：模擬失重 尾部懸吊大鼠模型 成骨細(xì)胞 miRNA
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R852.22
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表4-9
• 中文摘要9-12
• 英文摘要12-16
• 前言16-18
• 文獻(xiàn)回顧18-31
• 第一部分 模擬失重條件下大鼠股骨組織 miRNA 表達(dá)譜分析31-47
• 1 材料31-34
• 2 方法34-39
• 3 結(jié)果39-44
• 4 討論44-47
• 第二部分 miRNA-132-3p 對(duì)成骨細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)影響的研究47-61
• 1 材料47-49
• 2 方法49-54
• 3 結(jié)果54-59
• 4 討論59-61
• 第三部分 miRNA-132-3p調(diào)控成骨細(xì)胞功能的作用機(jī)制的研究61-74
• 1 材料61-63
• 2 方法63-67
• 3 結(jié)果67-72
• 4 討論72-74
• 小結(jié)74-76
• 參考文獻(xiàn)76-82
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果82-83
• 致謝83-84

【共引文獻(xiàn)】

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10 李麗詩(shī);高性能miRNA芯片技術(shù)SHUT assay平臺(tái)特異性研究[D];廣西師范大學(xué);2013年

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本文編號(hào)：265211