本文關(guān)鍵詞：MiR-206和miR-486及其相關(guān)調(diào)節(jié)因子在衛(wèi)星細(xì)胞增殖、分化中的變化

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【摘要】：研究目的骨骼肌損傷是運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練及日常生活中常見的損傷之一,但骨骼肌自我修復(fù)能力有限,在專業(yè)性運(yùn)動(dòng)員中,肌肉的反復(fù)損傷會(huì)引起肌肉炎癥,甚至出現(xiàn)肌肉纖維化,肌肉收縮能力下降,從而影響運(yùn)動(dòng)能力。肌肉損傷后,處于基膜和肌膜之間靜息狀態(tài)下的衛(wèi)星細(xì)胞會(huì)被激活,并通過增殖、分化等方式,相互融合成多核的肌管,修復(fù)損傷或壞死的肌纖維,從而修復(fù)受損的骨骼肌。而衛(wèi)星細(xì)胞的激活、增殖和分化過程中相關(guān)調(diào)節(jié)因子的變化還不是很清晰。以往的研究中主要用C2C12成肌細(xì)胞系來研究衛(wèi)星細(xì)胞的激活、增殖和分化,但用原代衛(wèi)星細(xì)胞來研究衛(wèi)星細(xì)胞的增殖及分化的比較少,用原代衛(wèi)星細(xì)胞來模擬細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)將更接近于活體研究。Micro RNA-206(mi R-206)和micro RNA-486(mi R-486)是在骨骼肌中特異性高表達(dá)的mi RNAs,而它們?cè)谛l(wèi)星細(xì)胞中的表達(dá)及其作用還不是十分清晰。本研究從SD乳鼠提取衛(wèi)星細(xì)胞,分為正常培養(yǎng)組和誘導(dǎo)分化組,比較兩組間或同組不同時(shí)間點(diǎn)mi R-206和mi R-486及其相關(guān)因子Pax7和Myf5的表達(dá)狀況,探究衛(wèi)星細(xì)胞增殖、分化過程中mi R-206和mi R-486及相關(guān)調(diào)節(jié)因子的表達(dá)變化,為豐富和進(jìn)一步完善肌肉再生理論提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù),進(jìn)而為骨骼肌損傷提供有效的新思路和手段具有重要意義。研究方法選用7日齡SD乳鼠,乙醚麻醉后75%酒精浸泡消毒,斷頭處死,取腓腸肌和比目魚肌,解剖鏡下迅速剝離脂肪、筋膜等組織;充分剪碎后用II型膠原酶、胰酶兩步消化法釋放衛(wèi)星細(xì)胞,胎牛血清終止消化;采用差速貼壁法來純化肌衛(wèi)星細(xì)胞。取3~5代衛(wèi)星細(xì)胞進(jìn)行干預(yù),實(shí)驗(yàn)分成兩組:正常培養(yǎng)組(GM組,高血清培養(yǎng))、誘導(dǎo)分化組(DM組,低血清培養(yǎng))。進(jìn)行以下檢測(cè):1、采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)橫紋肌肌動(dòng)蛋白(α-SCA)的表達(dá),對(duì)衛(wèi)星細(xì)胞的純度進(jìn)行鑒定。2、采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)正常培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化第5天衛(wèi)星細(xì)胞MHC的表達(dá)變化,對(duì)比衛(wèi)星細(xì)胞正常培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化后第5天的生長(zhǎng)狀況。3、采用PT-PCR檢測(cè)第1,2,3,5天正常培養(yǎng)組和誘導(dǎo)分化組衛(wèi)星細(xì)胞中Pax7、Myf5 m RNA的變化以及骨骼肌特異性mi R-206和mi R-486的變化。4、采用Western Blot檢測(cè)Pax7、Myf5蛋白水平的變化。為保證實(shí)驗(yàn)的可靠性,實(shí)驗(yàn)的每一步均需取不同批次的細(xì)胞重復(fù)三遍。研究結(jié)果1、衛(wèi)星細(xì)胞橫紋肌肌動(dòng)蛋白(α-SCA)免疫化學(xué)染色,免疫陽性為衛(wèi)星細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示衛(wèi)星細(xì)胞純度較高。2、酶聯(lián)免疫檢測(cè)結(jié)果顯示,誘導(dǎo)分化組在第5天MHC表達(dá)比正常培養(yǎng)組高,說明誘導(dǎo)分化組分化程度比較高。3、PCR結(jié)果1)正常培養(yǎng)組中,Pax7 m RNA的表達(dá)逐漸下降,第2、3、5天表達(dá)低于第1天,且有顯著性差異(P0.05)。誘導(dǎo)分化組表達(dá)逐漸下降,但無顯著性差異。兩組同時(shí)間點(diǎn)之間無顯著性差異。2)正常培養(yǎng)組中,Myf5 m RNA的表達(dá)逐漸下降。誘導(dǎo)分化組中不同時(shí)間點(diǎn)之間無顯著性差異。正常培養(yǎng)組中,Myf5 m RNA在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)都高于誘導(dǎo)分化組,但在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著性差異。3)Mi R-206在正常培養(yǎng)組和誘導(dǎo)分化組表達(dá)都先下降,再略微上升。但同組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間無顯著性差異。4)Mi R-486在在正常培養(yǎng)組和誘導(dǎo)分化組中表達(dá)與mi R-206表達(dá)大致相同,先下降,再略微上升。但同組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間無顯著性差異。4、Western Blot實(shí)驗(yàn):1)正常培養(yǎng)組和誘導(dǎo)分化組Pax7蛋白的表達(dá)情況,結(jié)果顯示,正常培養(yǎng)組Pax7蛋白表達(dá)呈逐漸下降趨勢(shì),和第1天相比,第5天Pax7蛋白的表達(dá)顯著下降(P0.05)。誘導(dǎo)培養(yǎng)組中,Pax7蛋白表達(dá)呈逐漸下降趨勢(shì),和第1天相比,第3、5天Pax7蛋白的表達(dá)顯著下降(P0.05)。兩組同時(shí)間點(diǎn)間無顯著性差異。2)正常培養(yǎng)組和誘導(dǎo)分化組Myf5蛋白的表達(dá)情況,結(jié)果顯示,正常培養(yǎng)組和誘導(dǎo)分化組Myf5蛋白表達(dá)都呈逐漸下降趨勢(shì),但無顯著性差異。結(jié)論1.通過兩步酶消化法和差速貼壁法提取的衛(wèi)星細(xì)胞具有增殖、分化的能力。衛(wèi)星細(xì)胞在高血清培養(yǎng)基中,細(xì)胞匯合度到達(dá)一定程度時(shí)也會(huì)向細(xì)胞分化方向發(fā)展。2.在衛(wèi)星細(xì)胞分化過程中,Pax7蛋白和Myf5蛋白表達(dá)下降,且Pax7促進(jìn)Myf5的表達(dá)。3.Mi R-206和mi R-486在不同培養(yǎng)基中出現(xiàn)的峰值不同,在增殖培養(yǎng)基中mi R-206和mi R-486在第3天表達(dá)最高,而在分化培養(yǎng)基中mi R-206和mi R-486在第1天表達(dá)最高。推測(cè)mi R-206和mi R-486在衛(wèi)星細(xì)胞融合成肌管初期表達(dá)上升。
【關(guān)鍵詞】：衛(wèi)星細(xì)胞 miR-206 miR-486 Myf5 Pax7
【學(xué)位授予單位】：上海體育學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：G804.7
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 英文縮略詞表9-12
• 1 前言12-13
• 2 文獻(xiàn)綜述13-19
• 2.1 Micro RNA-206的生物合成和作用機(jī)制13-14
• 2.1.1 Micro RNAs的生物合成13
• 2.1.2 Micro RNA-206的作用方式和調(diào)節(jié)機(jī)制13-14
• 2.2 Micro RNA-206在疾病中的表達(dá)14-15
• 2.2.1 Micro RNA-206在骨骼肌疾病中的表達(dá)14-15
• 2.2.2 Micro RNA-206在其他疾病中的表達(dá)15
• 2.3 Micro RNA-206在骨骼肌損傷和運(yùn)動(dòng)中的研究15-18
• 2.3.1 Micro RNA-206在肌肉損傷中的研究15-16
• 2.3.2 Micro RNA-206在運(yùn)動(dòng)中的研究16-18
• 2.4 Micro RNA-206的研究展望和應(yīng)用18-19
• 3 研究方法和實(shí)驗(yàn)步驟19-26
• 3.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象19
• 3.2 實(shí)驗(yàn)分組19
• 3.3 技術(shù)路線19-20
• 3.4 實(shí)驗(yàn)的主要儀器與設(shè)備20
• 3.5 主要試劑20
• 3.6 主要實(shí)驗(yàn)試劑配制20-21
• 3.7 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞原代培養(yǎng)方法21
• 3.8 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞純度鑒定方法21
• 3.9 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞誘導(dǎo)分化方法21
• 3.10 骨骼肌正常培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化后生長(zhǎng)狀況鑒定方法21-22
• 3.11 骨骼肌培養(yǎng)中micro RNA-206及其相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定方法22-25
• 3.11.1 RT-PCR的流程22-25
• 3.11.2 Western blot法檢測(cè)mi RNAs及相關(guān)基因蛋白表達(dá)25
• 3.12 數(shù)據(jù)處理25-26
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果26-31
• 4.1 大鼠衛(wèi)星細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察26-27
• 4.2 大鼠衛(wèi)星細(xì)胞的鑒定27-28
• 4.3 衛(wèi)星細(xì)胞正常培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化生長(zhǎng)狀況28
• 4.4 在正常培養(yǎng)組和誘導(dǎo)分化組mi R-206、mi R-486、Pax7 m RNA及Myf5m RNA的表達(dá)情況28-30
• 4.5 正常培養(yǎng)組和誘導(dǎo)分化組Pax7和Myf5蛋白表達(dá)情況30-31
• 5 討論分析31-37
• 5.1 大鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)分化模型的建立31-33
• 5.1.1 大鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的提取31-32
• 5.1.2 誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基的選擇32
• 5.1.3 衛(wèi)星細(xì)胞純度的鑒定32-33
• 5.1.4 衛(wèi)星細(xì)胞分化的鑒定33
• 5.2 正常培養(yǎng)組出現(xiàn)分化現(xiàn)象分析33-34
• 5.3 衛(wèi)星細(xì)胞正常培養(yǎng)組和誘導(dǎo)分化組pax7的變化特征34
• 5.4 衛(wèi)星細(xì)胞正常培養(yǎng)組和誘導(dǎo)分化組Myf5的變化特征34-35
• 5.5 衛(wèi)星細(xì)胞正常培養(yǎng)組和誘導(dǎo)分化組mi RNA-206和mi RNA-486的變化特征35-37
• 6 結(jié)論37
• 7 參考文獻(xiàn)37-42
• 致謝42

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本文編號(hào)：672893