本文關(guān)鍵詞：脂肪酶產(chǎn)生菌F.Oxysporum_SHM的分離鑒定及其發(fā)酵條件優(yōu)化

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【摘要】：脂肪酶是一種可以水解脂肪的酶類,催化脂肪水解為甘油和脂肪酸。動(dòng)物、植物和微生物都可以分泌脂肪酶,其中微生物脂肪酶廣泛應(yīng)用于脂肪的生產(chǎn)工業(yè)、去污工業(yè)和食品工業(yè)等領(lǐng)域。國(guó)內(nèi)外對(duì)脂肪酶研究涉及脂肪酶結(jié)構(gòu)催化特性、高產(chǎn)菌株選育和發(fā)酵條件控制等方面。本研究通過(guò)篩選鑒定得到一株具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的脂肪酶生產(chǎn)菌株F.Oxysporum_SHM,并對(duì)其發(fā)酵條件和脂肪酶粗酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行初步探討。首先采用橄欖油為唯一碳源的培養(yǎng)基從油脂實(shí)驗(yàn)室空氣、居民家灶臺(tái)和食堂附近土壤中篩選可以利用油脂的微生物,經(jīng)過(guò)初篩和復(fù)篩獲得一株酶活力相對(duì)較高菌株Y18,通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定確定其屬于叢梗孢科(Monilianceae)鐮孢菌屬(Fusarium LK)尖孢鐮刀菌(Fusarium Oxysporum),初步命名為F.Oxysporum_SHM。然后對(duì)該菌株發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。在選出適宜的基礎(chǔ)培養(yǎng)基后,對(duì)油脂、碳源、氮源、KH2PO4、Mg SO4、p H和裝液量等單因素進(jìn)行優(yōu)化,并利用響應(yīng)面設(shè)計(jì)(CCD)確定了發(fā)酵最優(yōu)條件,即:1%亞麻籽油、0.5 g/L Mg SO4?7H2O、2.0 g/L K2HPO4?3H2O、8.0 g/L蔗糖、30.0 g/L胰蛋白胨、p H8.0、裝液量30.0 m L/250 m L。在此條件下,預(yù)測(cè)發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶活力為5566.85 U/m L,實(shí)際測(cè)得發(fā)酵產(chǎn)酶活力為5216.23 U/m L,與模型預(yù)測(cè)接近。最后對(duì)F.Oxysporum_SHM脂肪酶粗酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行初步探討。通過(guò)硫酸銨鹽析、透析除鹽、Mono Q陰離子交換層析得到較純的F.Oxysporum_SHM脂肪酶,與發(fā)酵液相比純化了27.10倍。對(duì)透析除鹽后冷凍干燥的脂肪酶粗酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)分析,該酶最適溫度為40℃,并在45℃以下較穩(wěn)定;該酶最適p H 9.0,在p H3.0~10.0范圍內(nèi)較穩(wěn)定;Ca2+、Fe2+、Mn2+可以不同程度地提高脂肪酶活力,其中Fe2+作用顯著,酶活力提高181%,Mg2+、Cu2+對(duì)酶活力有抑制作用,分別保留了83.82%和76.98%的殘余酶活力;利用雙導(dǎo)數(shù)法測(cè)定該脂肪酶水解p-NPP的Km為270.36 mg/L、Vmax為25.91 nmol/min·mg;通過(guò)與兩種商品脂肪酶活力比較表明,F.Oxysporum_SHM脂肪酶活力較高,兩種商品僅為其活力的6.2%和13.6%。
【關(guān)鍵詞】：脂肪酶 尖孢鐮刀菌 分離鑒定 發(fā)酵條件優(yōu)化 陰離子交換層析
【學(xué)位授予單位】：上海大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：TQ925
【目錄】：

• 摘要9-10
• ABSTRACT10-12
• 第1章 緒論12-21
• 1.1 脂肪酶簡(jiǎn)介12
• 1.2 脂肪酶結(jié)構(gòu)12-13
• 1.3 脂肪酶催化特性和分類13-14
• 1.4 脂肪酶應(yīng)用14-15
• 1.5 脂肪酶國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展15-20
• 1.5.1 脂肪酶結(jié)構(gòu)與催化特性16
• 1.5.2 脂肪酶高產(chǎn)菌株選育16-17
• 1.5.3 脂肪酶發(fā)酵條件控制17-20
• 1.6 本課題研究的目的與意義20-21
• 第2章 脂肪酶產(chǎn)生菌F. Oxysporum_SHM的分離鑒定21-39
• 2.1 材料與試劑21-23
• 2.1.1 樣品采集21
• 2.1.2 主要儀器及設(shè)備21-22
• 2.1.3 主要生化試劑22
• 2.1.4 培養(yǎng)基22-23
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法23-27
• 2.2.1 脂肪酶活力測(cè)定23-24
• 2.2.2 菌株篩選24-25
• 2.2.3 菌株形態(tài)學(xué)鑒定25
• 2.2.4 菌株分子生物學(xué)鑒定25-27
• 2.3 結(jié)果與討論27-38
• 2.3.1 脂肪酶酶活力的測(cè)定27-29
• 2.3.2 脂肪酶產(chǎn)生菌株的富集和初篩29-30
• 2.3.3 脂肪酶產(chǎn)生菌株的復(fù)篩30-32
• 2.3.4 菌株形態(tài)學(xué)鑒定32-34
• 2.3.5 菌株分子生物學(xué)鑒定34-38
• 2.4 本章小結(jié)38-39
• 第3章 F. Oxysporum_SHM產(chǎn)脂肪酶發(fā)酵條件優(yōu)化39-61
• 3.1 材料和試劑39-41
• 3.1.1 菌株39
• 3.1.2 主要儀器及設(shè)備39-40
• 3.1.3 主要生化試劑40
• 3.1.4 培養(yǎng)基40-41
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法41-44
• 3.2.1 培養(yǎng)方法41
• 3.2.2 脂肪酶酶活力測(cè)定41
• 3.2.3 菌體量測(cè)定41
• 3.2.4 發(fā)酵液中總糖含量測(cè)定41-42
• 3.2.5 發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基選擇42
• 3.2.6 單因素實(shí)驗(yàn)42
• 3.2.7 響應(yīng)面分析42-43
• 3.2.8 生長(zhǎng)曲線繪制43
• 3.2.9 SDS-PAGE凝膠電泳43-44
• 3.2.10 數(shù)據(jù)分析44
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論44-60
• 3.3.1 發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基選擇44-45
• 3.3.2 油脂對(duì)發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶活力的影響45-46
• 3.3.3 碳源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶活力的影響46-47
• 3.3.4 氮源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶活力的影響47-50
• 3.3.5 磷酸二氫鉀和硫酸鎂對(duì)發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶活力的影響50-51
• 3.3.6 pH對(duì)發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶活力的影響51-52
• 3.3.7 裝液量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶活力的影響52-53
• 3.3.8 響應(yīng)面設(shè)計(jì)（CCD）確定發(fā)酵條件的最優(yōu)水平53-58
• 3.3.9 F. Oxysporum_SHM搖瓶發(fā)酵曲線58-60
• 3.4 本章小結(jié)60-61
• 第4章 F. Oxysporum_SHM脂肪酶酶學(xué)性質(zhì)分析61-73
• 4.1 材料和試劑61-62
• 4.1.1 主要儀器及設(shè)備61-62
• 4.1.2 主要生化試劑62
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法62-65
• 4.2.1 發(fā)酵上清液的制備62
• 4.2.2 脂肪酶活力測(cè)定62
• 4.2.3 發(fā)酵液的(NH4)2SO4沉淀62-63
• 4.2.4 粗酶液透析除鹽63
• 4.2.5 真空冷凍干燥制備粗酶粉63
• 4.2.6 粗酶的酶學(xué)性質(zhì)分析63-64
• 4.2.7 陰離子交換層析純化脂肪酶64
• 4.2.8 SDS-PAGE蛋白電泳分析64-65
• 4.2.9 蛋白濃度測(cè)定65
• 4.2.10 數(shù)據(jù)分析65
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論65-71
• 4.3.1 F. Oxysporum_SHM脂肪酶的純化65-67
• 4.3.2 F. Oxysporum_SHM脂肪酶最適溫度和溫度穩(wěn)定性67-68
• 4.3.3 F. Oxysporum_SHM脂肪酶最適pH和pH穩(wěn)定性68-70
• 4.3.4 金屬離子對(duì)F. Oxysporum_SHM脂肪酶活性影響70
• 4.3.5 F. Oxysporum_SHM脂肪酶米氏常數(shù)測(cè)定70-71
• 4.3.6 F. Oxysporum_SHM脂肪酶活性與商品酶活性比較71
• 4.4 本章小結(jié)71-73
• 參考文獻(xiàn)73-84
• 作者在攻讀碩士學(xué)位期間科研成果84-85
• 致謝85

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 縱偉;董海麗;;脂肪酶及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J];安徽農(nóng)學(xué)通報(bào);2007年15期

2 黃瑛;尹利;閆云君;;雙水相萃取法分離純化洋蔥假單胞菌G-63脂肪酶[J];現(xiàn)代化工;2007年S2期

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本文編號(hào)：946657