【摘要】：研究目的缺血性腦中風(fēng)是一類常見的腦血管疾病,具有發(fā)病迅速、病情復(fù)雜、致死和致殘率高等特點,被認為是本世紀最具有"影響力"的神經(jīng)系統(tǒng)疾病,嚴重危害人類健康。目前在臨床上針對該病的治療措施仍以藥物和手術(shù)溶栓為主,但由此帶來的再灌注損傷使患者遭受新的打擊。近年來越來越多的臨床研究提出缺血性腦中風(fēng)的最理想治療方案是"超早期溶栓治療+神經(jīng)保護劑",但遺憾的是,迄今為止世界上尚沒有得到權(quán)威機構(gòu)認可的滿意的抗缺血性腦中風(fēng)的神經(jīng)保護藥物上市。其中一個重要的原因是現(xiàn)有的治療策略主要針對單一的致病因素,缺乏多靶點抗缺血性腦中風(fēng)的藥物;而血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)對藥物在神經(jīng)系統(tǒng)分布的制約也成為影響其神經(jīng)保護作用發(fā)揮的重要因素。因此尋找理想的神經(jīng)保護藥物成為當今缺血性腦血管病治療的瓶頸,研究開發(fā)新型的神經(jīng)保護劑,具有很高的理論意義和應(yīng)用價值�？嵬【哂蟹肿有�、脂溶性高及高效載體轉(zhuǎn)運等特點,這些特點使其神經(jīng)系統(tǒng)靶向作用增強,而其支鏈衍生物進一步增加了血腦屏障的通過率,選作本研究中的重要的前體結(jié)構(gòu);川芎嗪是具有活血化瘀作用的中藥川芎的有效成分之一,臨床上主要用于治療缺血性心血管疾病,川芎醇(tetramethylpyrazine,TMP)是川芎嗪的體內(nèi)活性代謝產(chǎn)物,其細胞保護活性強于前體。以此為基礎(chǔ),根據(jù)前藥設(shè)計的原理將卡尼汀進行支鏈修飾,進一步增加脂溶性,并與川芎醇經(jīng)共價鍵連接,拼合在一個分子內(nèi)形成新型孿藥(twindrugs)一川芎醇卡尼酯系列化合物。本研究使用大腦中動脈栓線阻斷法(MCAO)和糖氧剝奪/再復(fù)氧(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)建立體內(nèi)外腦缺血再灌注(ischemia reperfusion,I/R)損傷模型,對新型孿藥川芎醇卡尼酯系列化合物神經(jīng)保護作用進行了系統(tǒng)的篩選和評價,并從炎癥反應(yīng),氧化應(yīng)激,能量代謝障礙以及線粒體結(jié)構(gòu)和功能的完整性等方面探討其發(fā)揮神經(jīng)保護作用的可能機制。實驗方法與結(jié)果1川芎醇卡尼酯系列化合物神經(jīng)保護活性的篩選體外培養(yǎng)高分化PC12細胞,OGD/R方法模擬體內(nèi)缺血再灌注損傷,CCK-8檢測試劑盒測定細胞的存活率。通過對不同濃度的10個受試化合物的神經(jīng)保護作用進行篩選,并計算半數(shù)有效濃度(EC50)值,發(fā)現(xiàn)化合物L(fēng)R134,LR137,LR140,LR143的EC50值低于100nM,用于后期體內(nèi)實驗。因化合物L(fēng)R134的EC50值最小,以此進行體內(nèi)給藥劑量和給藥時間的篩選。采用大腦中動脈栓線阻斷法建立局灶性缺血再灌注損傷模型。在充分預(yù)實驗的基礎(chǔ)上,設(shè)定術(shù)前120min,30min和術(shù)后Omin三個給藥時間,1.25,2.5,5 mg/kg三個給藥劑量。TTC染色、神經(jīng)行為學(xué)評分及水腫指數(shù)結(jié)果顯示術(shù)前120min給藥無明顯神經(jīng)保護作用,術(shù)前30min和術(shù)后立即給予2.5,5mg/kg化合物L(fēng)R134可顯著降低腦梗死體積,改善神經(jīng)行為學(xué)功能,減輕腦水腫。選取發(fā)揮神經(jīng)保護作用的最小有效濃度2.5mg/kg(換算成摩爾濃度為6.82μmol/kg)作為給藥劑量。前期藥代動力學(xué)研究顯示,化合物L(fēng)R134給藥30min后在腦組織分布達高峰,與術(shù)后Omin給藥相比,術(shù)前30min給藥具有更好的神經(jīng)保護作用,因此選取術(shù)前30min作為給藥時間。2川芎醇卡尼酯系列化合物的神經(jīng)保護作用術(shù)前30min給予6.82μmol/kg的川芎醇卡尼酯類化合物L(fēng)R134,LR137,LR140和LR143,并以其前體化合物L(fēng)-卡尼汀和川芎醇作為對照。結(jié)果顯示除化合物L(fēng)R134外,LR143對局灶性腦缺血再灌注損傷也具有顯著的神經(jīng)保護作用,但在此劑量下的化合物L(fēng)R137,LR140及前體L-卡尼汀和川芎醇沒有明顯的神經(jīng)保護作用。進一步使用蘇木素伊紅染色(Hematoxylineosin,HE)和尼氏染色(Nissl)染色的方法,發(fā)現(xiàn)化合物L(fēng)R134和LR143可顯著減輕缺血再灌注引起的神經(jīng)細胞變性、損傷,明顯改善神經(jīng)元的存活狀態(tài)。使用熒光標記的TUNEL試劑盒,發(fā)現(xiàn)化合物L(fēng)R134和LR143可顯著減少腦缺血再灌注引起的腦組織細胞凋亡。進一步證實新型孿藥川芎醇卡尼酯系列化合物L(fēng)R134和LR143對腦缺血再灌注損傷具有神經(jīng)保護作用。3川芎醇卡尼酯系列化合物L(fēng)R134和LR143神經(jīng)保護作用的機制缺血性腦中風(fēng)的發(fā)病機制非常復(fù)雜,研究認為與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、能量代謝缺陷、線粒體功能障礙和Ca2+超載等有關(guān),本實驗即從這幾方面入手,對川芎醇卡尼酯類化合物神經(jīng)保護作用機制進行初步探討。分別使用實時定量RT-PCR和免疫熒光染色法(immunofluorescence,IF)檢測腦組織中炎癥因子的mRNA水平和炎性細胞的浸潤情況,結(jié)果顯示化合物L(fēng)R134和LR143可顯著減低缺血再灌注損傷引起的炎癥因子的過度表達及中性粒細胞和巨噬細胞的浸潤。用電子自旋共振(Electron Spin Resonance,ESR)波譜法檢測腦組織中超氧陰離子(O2·-)水平,結(jié)果表明化合物L(fēng)R134和LR143可顯著減少缺血再灌注產(chǎn)生的超氧陰離子。免疫印跡法(Western-blot,WB)發(fā)現(xiàn)化合物L(fēng)R134和LR143可以顯著降低腦缺血再灌注損傷模型中NADPH氧化酶(NADPH oxidase)NOX2的表達,而使用免疫熒光雙標的方法證實缺血再灌注會引起腦組織神經(jīng)元細胞中NOX2的表達顯著增加,這種變化可以被兩種候選化合物所緩解。應(yīng)用透射電子顯微鏡(TME)觀察神經(jīng)元和線粒體的超微結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)化合物L(fēng)R134和LR143均可顯著減輕腦缺血再灌注損傷中腦組織皮層神經(jīng)元和線粒體結(jié)構(gòu)損害。提取腦組織皮層線粒體,通過免疫印跡法分別檢測腦組織胞漿和線粒體中的細胞色素C的蛋白表達量,結(jié)果表明化合物L(fēng)R134和LR143可抑制缺血再灌注引起的線粒體細胞色素C向胞漿釋放。熒光素酶法檢測腦組織中ATP含量,WB檢測各組腦組織中能量感受器AMPK的磷酸化水平,結(jié)果顯示化合物L(fēng)R134和LR143能夠顯著改善能量代謝缺陷,并糾正由缺血再灌注引起的AMPK的過度激活。體外實驗也得到相似的結(jié)果。結(jié)論與創(chuàng)新性結(jié)論:川芎醇卡尼酯系列化合物對缺血性腦中風(fēng)具有神經(jīng)保護作用,其機制與減輕缺血再灌注炎癥反應(yīng)、保護線粒體結(jié)構(gòu)和功能、改善能量代謝缺陷及減少細胞內(nèi)鈣超載等有關(guān),有望發(fā)展成為臨床上用于缺血性中風(fēng)的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新型神經(jīng)保護劑。創(chuàng)新性:本實驗所用的川芎醇卡尼酯系列化合物完全自主設(shè)計、研發(fā)、合成的具有全新結(jié)構(gòu)的單體化合物;本研究首次通過體內(nèi)外實驗對新型孿藥川芎醇卡尼酯系列化合物的神經(jīng)保護活性進行系統(tǒng)的篩選和評價;首次對新型孿藥川芎醇卡尼酯系列化合物對缺血性腦中風(fēng)的保護作用機制進行探討。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

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本文編號：2395960