【摘要】：高內(nèi)涵篩選技術(shù)(high content screening, HCS)是根據(jù)在細(xì)胞內(nèi)獲取多個(gè)靶標(biāo)的熒光數(shù)據(jù),而建立起來的篩選方法。并且HCS能夠在保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能完整性的前提下,檢測(cè)被篩樣品對(duì)細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)、分化、遷移、凋亡、代謝途徑及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等各個(gè)環(huán)節(jié)的影響。此外,HCS還能在單一實(shí)驗(yàn)中獲取大量與基因、蛋白及其他細(xì)胞成分相關(guān)的信息,確定其生物活性和潛在毒性。同時(shí),HCS也是一種應(yīng)用高分辨率的熒光數(shù)碼影像系統(tǒng),旨在獲得被篩樣品對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的多維立體和實(shí)時(shí)快速的生物效應(yīng)信息,在細(xì)胞水平上檢測(cè)多個(gè)指標(biāo)的多元化、功能性篩選技術(shù)平臺(tái),它是交叉多個(gè)學(xué)科的方法。本論文主要開展調(diào)控paraspeckles新型小分子化合物的高內(nèi)涵篩選的建立與優(yōu)化及神經(jīng)干細(xì)胞高內(nèi)涵篩選模型的建立與優(yōu)化這兩方面的工作。 Paraspeckles是最新發(fā)現(xiàn)的位于哺乳動(dòng)物染色體區(qū)間的亞細(xì)胞核結(jié)構(gòu)體,由長(zhǎng)鏈非編碼RNA-NEAT1與DBHS蛋白家族構(gòu)成的結(jié)構(gòu)復(fù)雜的RNA-蛋白復(fù)合體。Paraspeckles通過識(shí)別RNA的3’端非編碼區(qū)域存在的經(jīng)A-to-Ⅰ編輯的反向重復(fù)序列,將特定RNA滯留于核內(nèi),調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)。在多種細(xì)胞生命活動(dòng)過程中如應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞分化和病毒感染等,paraspeckles結(jié)構(gòu)體能有效調(diào)控基因表達(dá),參與生理病理過程。但是迄今為止,paraspeckles的具體功能和調(diào)控機(jī)制還不是非常明確。本課題擬以細(xì)胞核中paraspeckles結(jié)構(gòu)體數(shù)量的顯著性變化為指標(biāo),通過高內(nèi)涵篩選化合物庫,希望獲得可有效調(diào)控paraspeckles結(jié)構(gòu)體數(shù)量的小分子化合物,并以其為探針工具對(duì)paraspeckles結(jié)構(gòu)體調(diào)控機(jī)制及生理功能進(jìn)行更加深入的研究。 本論文中,在前期構(gòu)建過表達(dá)EYFP-PSP1α的HEK293細(xì)胞系和鑒定EYFP-PSP1α能夠標(biāo)記paraspeckles結(jié)構(gòu)體在細(xì)胞中的定位與數(shù)量的基礎(chǔ)上,優(yōu)化高內(nèi)涵篩選模型相關(guān)條件,如細(xì)胞密度、細(xì)胞板的選擇、免疫組化實(shí)驗(yàn)步驟、熒光成像拍攝條件等,以及根據(jù)paraspeckle實(shí)際大小,調(diào)整高內(nèi)涵數(shù)據(jù)圖像分析參數(shù)如熒光點(diǎn)的長(zhǎng)、寬、體積及熒光強(qiáng)度等參數(shù),從而確立高內(nèi)涵篩選模型及分析條件,Z’因子為0.71,符合篩選質(zhì)控要求。進(jìn)一步對(duì)具有生理活性的2560個(gè)天然產(chǎn)物和生物活性分子庫中的1906個(gè)已知功能的藥理活性分子進(jìn)行快速、大批量篩選,在4466個(gè)化合物中,發(fā)現(xiàn)140個(gè)化合物可顯著改變細(xì)胞中paraspeckles數(shù)量的新型化合物。之后,對(duì)篩選出的化合物進(jìn)行復(fù)篩,確定12個(gè)化合物可以顯著降低細(xì)胞內(nèi)paraspeckles的數(shù)量。最后,使用Vestern Blotting、熒光原位雜交和Northern Blot對(duì)篩選出的化合物進(jìn)行驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)這些化合物確實(shí)能夠減少NEAT1(?)勺表達(dá)量,證明該高內(nèi)涵篩選模型的可行性。下一步,我們將計(jì)劃以篩選到的小分子化合物為工具探針,進(jìn)一步研究相關(guān)信號(hào)通路對(duì)paraspeckles的調(diào)控機(jī)制及其可能的生理病理意義。 神經(jīng)干細(xì)胞是一群具有分化為神經(jīng)元細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞的能力,可自我更新并足以提供大量腦組織細(xì)胞的細(xì)胞群。神經(jīng)干細(xì)胞的研究是目前神經(jīng)科學(xué)研究的前沿領(lǐng)域,不僅因?yàn)槠鋵?duì)神經(jīng)發(fā)育研究的重要性,更主要的是其對(duì)神經(jīng)退行性疾病具有潛在的治療價(jià)值。無論是體外神經(jīng)細(xì)胞的移植還是內(nèi)源性神經(jīng)的激活,首先都需要充分了解神經(jīng)干細(xì)胞在生理或病理過程中增殖和定向分化的精密調(diào)控機(jī)制,從而實(shí)現(xiàn)高效可控的誘導(dǎo)其分化產(chǎn)生功能神經(jīng)元或特定類型神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。最近幾年,化學(xué)生物學(xué)研究方興未艾,基于化學(xué)生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)小分子探針不僅可作為重要的工具化合物有力推動(dòng)神經(jīng)干細(xì)胞的基礎(chǔ)研究,更由于其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易于進(jìn)入血腦屏障和進(jìn)一步結(jié)構(gòu)優(yōu)化的特點(diǎn),具有基于干細(xì)胞研究方向的新一代藥物研發(fā)前景。此外,對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞定向分化誘導(dǎo)的探索也將為我們的中藥現(xiàn)代化研究帶來新的切入點(diǎn)。因此,本課題擬建立神經(jīng)干細(xì)胞定向分化高內(nèi)涵篩選模型,希望通過對(duì)國(guó)家化合物樣品庫具有結(jié)構(gòu)多樣性的天然產(chǎn)物庫、生物活性分子庫及多樣性庫進(jìn)行大量、隨機(jī)、準(zhǔn)確的篩選,找到能高效調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞定向分化的誘導(dǎo)劑并對(duì)其作用機(jī)制作進(jìn)一步探討,這不僅有助于深化對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化調(diào)節(jié)機(jī)制的認(rèn)識(shí),而且有望找到具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的先導(dǎo)化合物作為治療神經(jīng)退行性疾病等中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的藥物。 本論文中,首先分離E12.5-E13.5天原代胚胎大腦皮層神經(jīng)干細(xì)胞,進(jìn)行單層培養(yǎng)。利用增殖培養(yǎng)基及分化培養(yǎng)基培養(yǎng)及處理神經(jīng)干細(xì)胞,免疫細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志蛋白Nestin、神經(jīng)元標(biāo)志蛋白β Ⅲ-Tubulin及星型膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白GFAP表達(dá)量,鑒定所分離傳代培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞具有自我更新和分化能力。確認(rèn)用于高內(nèi)涵篩選所用的神經(jīng)干細(xì)胞原代分離條件如小鼠品系確定、孕鼠天數(shù)、分離部位、分離方法、細(xì)胞代數(shù)、細(xì)胞傳代條件、細(xì)胞貼壁培養(yǎng)等。然后建立和優(yōu)化高內(nèi)涵篩選模型相關(guān)條件,包括細(xì)胞接種密度、分化過程中是否半數(shù)換液、分化時(shí)間和DMSO濃度、成像條件、免疫組化條件等,以及確定高內(nèi)涵圖像分析參數(shù),包括通過細(xì)胞核染色熒光強(qiáng)度確定研究對(duì)象,通過β Ⅲ-Tubulin免疫熒光強(qiáng)度確定神經(jīng)元數(shù)量等。以GSK3-beta抑制劑BIO為陽性化合物,計(jì)算Z’-因子為0.45,屬于可接受范圍。下一步,我們將對(duì)國(guó)家化合物樣品庫具有結(jié)構(gòu)多樣性的天然產(chǎn)物、生物活性分子庫及多樣性庫進(jìn)行隨機(jī)、準(zhǔn)確的篩選,希望找到能高效調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞定向分化的誘導(dǎo)劑并對(duì)其作用機(jī)制作進(jìn)一步探討。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R965.1

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2393571