發(fā)布時(shí)間：2018-12-25 17:51

【摘要】：背景： 缺血性腦血管病已成為臨床上的常見病、多發(fā)病，致殘率、病死率及復(fù)發(fā)率均高。近年來，影像學(xué)發(fā)展突飛猛進(jìn)，血管內(nèi)介入治療腦血管病在臨床上廣泛開展，使缺血性腦血管病復(fù)發(fā)率、病死率顯著降低。但是由于經(jīng)皮血管成形術(shù)（percutaneoustransluminal angioplasty PTA）如支架植入、球囊擴(kuò)張等導(dǎo)致血管狹窄部位局部損傷，引起血管過度修復(fù)反應(yīng)，，導(dǎo)致術(shù)后再狹窄成為了該項(xiàng)治療的發(fā)展的瓶頸。一項(xiàng)CREST試驗(yàn)研究表明，頸動脈支架術(shù)后，兩年內(nèi)再狹窄的發(fā)生率為6.0%，在吸煙、高血壓、高血脂及糖尿病患者發(fā)生率更高[1]。因此再狹窄防治不容忽視。在血管成形術(shù)后再狹窄的病理生理機(jī)制研究中，人們發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷是這一系列病理過程的始動因素[2]，可以引起血管平滑肌細(xì)胞病理性增殖等系列改變。而炎癥反應(yīng)在內(nèi)皮損傷中起關(guān)鍵的作用[3]。因此，血管成形術(shù)以后炎癥反應(yīng)的防治成為了防治再狹窄的關(guān)鍵。 目前大量研究表明A20基因是內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)性基因，同時(shí)具有抗炎作用[4-5]，因此A20基因可能具有抑制再狹窄的作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn)攜帶A20基因的血管內(nèi)支架能明顯改善支架術(shù)后再狹窄，說明通過A20修飾可構(gòu)建具有抗再狹窄作用的血管內(nèi)支架[6]。但是支架直接攜帶目的基因存在著效率低、穩(wěn)定性差等問題。人工鋅指轉(zhuǎn)錄因子（zinc finger artificialtranscription factor ZF-ATF）技術(shù)能夠高效穩(wěn)定地誘導(dǎo)目的基因表達(dá)。本課題主要構(gòu)建A20基因ZF-ATF的真核表達(dá)載體，啟動內(nèi)源性A20基因的高水平表達(dá)，研究其生物學(xué)功能，為最終構(gòu)建擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的ZF-ATF修飾的血管內(nèi)支架奠定基礎(chǔ)。 目的： 1.構(gòu)建A20基因的人工鋅指轉(zhuǎn)錄因子（ZF-ATF）的真核表達(dá)載體。 2.觀察ZF-ATF轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（Human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）后對內(nèi)源性A20基因的表達(dá)調(diào)控及對HUVEC細(xì)胞增殖、遷移能力的影響。 3.研究人工鋅指轉(zhuǎn)錄因子對LPS誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響并探討其可能的機(jī)制。 方法： 1.根據(jù)人A20基因ZF-ATF的序列，設(shè)計(jì)出其引物，以質(zhì)粒DNApUC19-ZF-ATF為模板，通過PCR擴(kuò)增出目的基因片段ZF-ATF，再通過BamH Ⅰ和KpnⅠ酶切后的載體連接產(chǎn)生ZF-ATF真核載體，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5α，篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，限制性內(nèi)切酶酶切鑒定，鑒定陽性克隆進(jìn)行測序。 2. ZF-ATF轉(zhuǎn)染HUVEC細(xì)胞，用含G418300μg／mL的1640培養(yǎng)液進(jìn)行穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選。 3.通過Western blot檢測轉(zhuǎn)染ZF-ATF后內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)源性A20蛋白的表達(dá)。 4. MTT實(shí)驗(yàn)觀察轉(zhuǎn)染ZF-ATF后HUVEC細(xì)胞的增殖能力，transwells實(shí)驗(yàn)檢測HUVEC細(xì)胞遷移能力。 5.用脂多糖（LPS）誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，利用Western blot檢測NF-κBp65的表達(dá)情況，利用ELISA檢測TNF-α、IL-6、IL-8等。 6.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GrapPad Prism5軟件處理，Mann-Whitney U檢驗(yàn)用于比較炎癥因子的差異。 結(jié)果： 1.通過限制性內(nèi)切酶酶切鑒定及DNA測序證實(shí)ATF插入正確，成功構(gòu)建A20人工鋅指轉(zhuǎn)錄因子的真核表達(dá)載體。 2. ZF-ATF轉(zhuǎn)染HUVEC細(xì)胞，成功篩選出HUVEC細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)系，Western blot證實(shí)ZF-ATF轉(zhuǎn)染HUVEC后內(nèi)源性A20蛋白表達(dá)量顯著增加（P＜0.01）。 3. ZF-ATF轉(zhuǎn)染HUVEC細(xì)胞后抑制了其增殖能力，增強(qiáng)了遷移能力。 4. ELISA法檢測結(jié)果表明，LPS刺激前后，空載組及空白組細(xì)胞因子表達(dá)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，LPS刺激后均明顯上調(diào)(空白組IL-6:126±28.8vs738±70.1， IL-8：110±33.9vs724±72.3，TNF-α：9.8±1.5vs41±8.9，P＜0.05；空載體組：IL-6：134±11.4vs712±110.3，IL-8：110±29.1vs762±10.6， TNF-α：7.6±2.3vs42±9.1P＜0.05)，ZF-ATF轉(zhuǎn)染組細(xì)胞因子也有明顯上調(diào)（IL-6:130±35.4vs292±44.9， IL-8：96±18.2vs328±76.3，TNF-α：7.2±2.6vs21±4.2P＜0.05），但ZF-ATF轉(zhuǎn)染組細(xì)胞因子的上調(diào)水平?jīng)]有空白組及空載組上調(diào)水平高，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（IL-8、IL-6P＜0.01，TNF-α P＜0.05），ZF-ATF轉(zhuǎn)染組與空白組比較細(xì)胞因子表達(dá)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（IL-8、IL-6P＜0.01，TNF-α P＜0.05），而空載組與空白組比較LPS刺激前后細(xì)胞因子的表達(dá)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。Western blot證實(shí)在LPS刺激后ZF-ATF轉(zhuǎn)染組NF-κB p65的表達(dá)（19.8±4.5）較空載組（90.2±5.9）及空白組（96.3±3.3）顯著下調(diào)（P＜0.01）。 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建人工鋅指轉(zhuǎn)錄因子真核表達(dá)載體，且能夠啟動內(nèi)源性A20基因的穩(wěn)定表達(dá)。 2. ZF-ATF轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力。 3. ZF-ATF轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞能夠抑制LPS誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能與A20通過阻斷NF-κB通路有關(guān)。 4. A20通過阻斷NF-κB通路抑制炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R743.3

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 朱楚洪,應(yīng)大君,糜建紅,董世武,張偉,魏勇;A20基因在動脈粥樣硬化損傷中對內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用[J];中華老年心腦血管病雜志;2003年05期

2 魏勇;應(yīng)大君;侯春麗;朱楚洪;崔曉萍;邢艷;郭洪峰;;人工鋅指蛋白(ZFP)的設(shè)計(jì)及原核表達(dá)分析[J];生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志;2008年03期

本文編號：2391446