本文選題：草酸青霉　切入點：纖維素酶　出處：《山東大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：光合作用制造的植物生物質(zhì)是地球上最為豐富的可再生資源。開發(fā)和轉(zhuǎn)化這類大宗底物為生物燃料或化學(xué)品是解決我國面臨的能源和環(huán)境危機(jī)的重要途徑。然而, 高成本的纖維素酶是制約木質(zhì)纖維素乙醇商業(yè)化的主要瓶頸。在自然界中,許多絲狀真菌可以分泌大量的木質(zhì)纖維素降解酶。因此,這些微生物被開發(fā)利用,并成為商品酶制劑的主要生產(chǎn)者。絲狀真菌的纖維素酶在轉(zhuǎn)錄水平上受到嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目刂�。草酸青霉是本實驗室篩選獲得的纖維素酶高產(chǎn)菌株,其突變菌株已成功用于工業(yè)纖維素酶的生產(chǎn),并擁有自主知識產(chǎn)權(quán)。 研究表明,在草酸青霉中,存在著尚未闡明的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。本實驗室前期工作借助二代測序手段開展了野生菌株和高產(chǎn)突變株的比較基因組學(xué)研究,發(fā)現(xiàn)氨基酸發(fā)生變異的蛋白質(zhì)中顯示了轉(zhuǎn)錄因子活性的富集。這些結(jié)果暗示了在纖維素酶降解真菌草酸青霉中許多轉(zhuǎn)錄因子及其介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制決定了纖維素酶的產(chǎn)量,并且在纖維素酶的表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中處于核心位置。為了深入理解影響纖維素酶合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制,并系統(tǒng)解析突變株高產(chǎn)的分子機(jī)理,進(jìn)而改造纖維素酶的表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以進(jìn)一步提高菌株的產(chǎn)酶能力,我們圍繞幾個關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子開展了一系列的研究工作,取得了重要進(jìn)展。1.解析了轉(zhuǎn)錄因子ClrB, CreA, AmyR和XlnR調(diào)控纖維素酶表達(dá)的分子機(jī)理研究結(jié)果表明,ClrB是調(diào)控纖維素酶表達(dá)的關(guān)鍵激活因子,它的缺失不僅抑制草酸青霉在纖維素平板上的生長,并且?guī)缀踝钄嗔怂兄饕w維素酶基因的表達(dá)。clrb敲除株與野生株之間的比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究發(fā)現(xiàn),ClrB依賴的生物學(xué)過程主要涉及植物生物質(zhì)多糖的降解利用和寡糖的轉(zhuǎn)運,表明ClrB是纖維素酶專屬轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。CreA是抑制纖維素酶表達(dá)的關(guān)鍵阻遏蛋白,敲除creA基因不僅可以顯著提高纖維素酶表達(dá),而且可以上調(diào)激活因子ClrB的水平。此外我們還發(fā)現(xiàn),CreA還參與了絲狀真菌的營養(yǎng)生長和無性發(fā)育等過程的調(diào)控。AmyR正向激活淀粉酶的表達(dá),同時反向抑制了纖維素酶的表達(dá)。AmyR的缺失阻斷胞外淀粉酶的合成,但是大幅度提升了纖維素酶的產(chǎn)量。XlnR在草酸青霉中主要調(diào)控半纖維素酶基因的表達(dá)活性,同時在一定程度上影響了纖維素酶基因的表達(dá)�？傊�,轉(zhuǎn)錄因子ClrB, CreA, AmyR和XlnR是決定草酸青霉纖維素酶表達(dá)活性最為核心的4個轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白。2.轉(zhuǎn)錄因子劑量依賴性及蛋白互作介導(dǎo)的協(xié)同性決定了纖維素酶基因的表達(dá)水平及纖維素酶產(chǎn)量。過表達(dá)激活因子ClrB或XlnR顯著上調(diào)纖維素酶基因表達(dá)水平, 增加了纖維素酶的產(chǎn)量。而過表達(dá)阻遏蛋白CreA顯著下調(diào)纖維素酶基因的表達(dá),進(jìn)而減少胞外水解酶的分泌。這些研究結(jié)果表明,纖維素酶的水平與轉(zhuǎn)錄激活因子ClrB或XlnR的水平成正相關(guān),而與阻遏蛋白CreA或AmyR的水平成負(fù)相關(guān)。更為重要的是, 同時過表達(dá)激活因子ClrB和XlnR顯著協(xié)同增強(qiáng)纖維素酶的表達(dá)活性。缺失CreA或AmyR組合過表達(dá)激活因子ClrB (gpd(P)::clrB-ΔcreA和gpd(P)::clrB-ΔamyR)同樣能協(xié)同提高纖維素酶的表達(dá)水平和纖維素酶產(chǎn)量。有趣的是,突變株gpd(P)::clrB-ΔcreA在不依賴誘導(dǎo)物時所分泌的纖維素酶量相當(dāng)于纖維素誘導(dǎo)條件下野生型菌株的纖維素酶產(chǎn)量。同時缺失CreA和AmyR在誘導(dǎo)纖維素酶表達(dá)中也顯示了明顯的正協(xié)同效應(yīng)�？傊�,進(jìn)一步分析雙基因突變株gpd(P)::clrB-gpd(P)::xlnR, gpd(P)::clrB-gpd(P)::creA, gpd(P)::clrB-ΔamyRΔ amyR-ΔcreA和gpd(P)::clrB-AcreA中纖維素酶的表達(dá)水平,并與各自對應(yīng)的單基因突變株進(jìn)行比較研究的結(jié)果進(jìn)一步明確了轉(zhuǎn)錄因子劑量所維穩(wěn)的“蹺蹺板模型”在草酸青霉纖維素酶表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。纖維素酶基因的表達(dá)水平和纖維素酶產(chǎn)量與激活因子XlnR或ClrB劑量成正相關(guān), 而與阻遏蛋白CreA 或劑量成負(fù)相關(guān)。轉(zhuǎn)錄因子AmyR與ClrB和XlnR之間的互作得到了酵母AmyR雙雜交(Y2H)和雙分子互補(bǔ)熒光證據(jù)的強(qiáng)烈支持,這種互作也被認(rèn)為(BiFC)在協(xié)同調(diào)控纖維素酶表達(dá)中發(fā)揮了重要作用。凝膠阻滯試驗證實了轉(zhuǎn)錄因子和ClrB, CreA通過直接結(jié)合纖維素酶基因的啟動子發(fā)揮調(diào)控作用。對轉(zhuǎn)錄XlnR因子和CreA相關(guān)突變株的比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)了不同的木質(zhì)纖維素ClrB酶組分對轉(zhuǎn)錄因子的差異響應(yīng)。3.功能鑒定了核小體重塑復(fù)合物RSCA,發(fā)現(xiàn)其參與了營養(yǎng)生長,CWI,纖維素酶表達(dá)等生物學(xué)過程。初步探索了核小體重塑蛋白RSCA在絲狀真菌中的生物學(xué)功能�；蚯贸芯棵鞔_了RSCA對于保持細(xì)胞壁完整性是非常關(guān)鍵的。其中一個關(guān)鍵的幾丁質(zhì)合酶的表達(dá)是嚴(yán)格依賴活性RSCA的。本研究首次發(fā)現(xiàn)了核小體重塑蛋白RSCA參與草酸青霉纖維素酶基因的表達(dá)調(diào)控,并且與阻遏蛋白CreA互作。RSCA和CreA在纖維素酶表達(dá)調(diào)控中相互作用的分子機(jī)制尚需要深入研究。4.鑒定和功能研究了轉(zhuǎn)錄因子PoFlbC,并明確了其在草酸青霉纖維素酶表達(dá)中的關(guān)鍵作用鑒定了構(gòu)巢曲霉上游發(fā)育調(diào)控因子FlbC在草酸青霉中的直系同源蛋白PoFlbC�；蚯贸芯勘砻�,PoFlbC的缺失導(dǎo)致了主要生孢基因brlA的表達(dá)下調(diào)及分生孢子產(chǎn)量的降低。而過表達(dá)菌株OEPoflbC在分生孢子的發(fā)生和產(chǎn)量方面也表現(xiàn)出一定的缺陷。這表明草酸青霉的分生孢子形成受到PoFlbC的平衡調(diào)控,可能同時受到PoflbC過表達(dá)的反饋抑制。盡管在曲霉中,與生孢相關(guān)的上游調(diào)控因子已經(jīng)得到了廣泛的研究,但是青霉屬中同源蛋白的功能研究只有零星的報道。我們首次揭示了PoFlbC在纖維素酶的表達(dá)中也發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn),PoFlbC的缺失導(dǎo)致了幾乎所有的纖維素酶和部分半纖維素酶基因的表達(dá)下調(diào)。有趣的是主要多糖裂解酶AA9-A(以前命名為GH61A)編碼基因的誘導(dǎo)表達(dá)嚴(yán)格依賴于活性PoFlbC。這些結(jié)果暗示,PoFlbC有可能特異性地調(diào)控多糖裂解酶所主導(dǎo)的木質(zhì)纖維素的氧化降解過程。5.理性重構(gòu)纖維素酶的表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò),構(gòu)建纖維素酶高產(chǎn)菌株基于上述研究結(jié)果,我們對草酸青霉野生菌株114-2進(jìn)行了系統(tǒng)的遺傳工程改造：增強(qiáng)誘導(dǎo)調(diào)控同時降低阻遏效應(yīng)。通過組合過表達(dá)了轉(zhuǎn)錄因子ClrB和雙敲除CreA及胞內(nèi)p-葡萄糖苷酶BGL2,實現(xiàn)了對草酸青霉纖維素酶的表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)重構(gòu),獲得了纖維素酶高產(chǎn)突變株RE-10。RE-10的纖維素酶活力和分泌的胞外蛋白量相較于野生菌株分別提高了30倍和10倍。更重要的是,RE-10的纖維素酶產(chǎn)量甚至超過了長期誘變選育出的工業(yè)菌株JU-A10-T。比較分泌組學(xué)研究證明,在RE-10中參與木質(zhì)纖維素降解的蛋白包括纖維素酶,半纖維素酶,多糖裂解酶的豐度表現(xiàn)出特異性的上調(diào)。美中不足的是,RE-10中的β-葡萄糖苷酶并沒有以相應(yīng)幅度提高。所占比例反而有所下降。因此,為了彌補(bǔ)RE-10中p-葡萄糖苷酶活力的不足,我們分別采用兩種策略在RE-10中過表達(dá)p-葡萄糖苷酶。來自核糖體40S蛋白S8的啟動子被用于過表達(dá)3種β-葡萄糖苷酶(BG1, BG4,和BG5)。所有的突變株的BG酶活,轉(zhuǎn)錄本豐度和蛋白量均明顯提高。胞內(nèi)p-葡萄糖苷酶bgl2.基因的啟動子也被用于誘導(dǎo)性地表達(dá)BGL1和BGL4。這種誘導(dǎo)表達(dá)策略進(jìn)一步增強(qiáng)了p-葡萄糖苷酶的表達(dá)活性。BGLl的過表達(dá)菌株I1-13的p-葡萄糖苷酶活相較于RE-10提高了65倍,高達(dá)150 U/ml,顯著高于已報道的其他高產(chǎn)菌株所分泌的粗酶液中的BG水平。所有的這些BGL過表達(dá)突變株都增強(qiáng)了對微晶纖維素的利用及濾紙的水解。BGL突變株的粗酶液對脫木素木糖渣(DCCR)的水解效率相較于出發(fā)菌株大幅度提升,顯著降低了酶的用量。值得一提的是,BGL4過表達(dá)突變株粗酶液的轉(zhuǎn)化率在糖化前期基本上與經(jīng)過改良的商品酶相當(dāng)。本研究所建立的理性的菌株遺傳工程改造實現(xiàn)了在基因調(diào)控層面對菌株的酶系進(jìn)行改良和優(yōu)化,減少了酶系濃縮,復(fù)配,添加等一系列耗時費力的下游生物加工工藝,在纖維素乙醇的商業(yè)化生產(chǎn)中顯示了光明的前景。總之,這些研究成果不僅有助于草酸青霉纖維素酶表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型的完善,豐富了對絲狀真菌纖維素酶復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理的認(rèn)識,而且為纖維素酶高產(chǎn)菌株的改造提供了重要的靶點。通過遺傳工程策略,理性重構(gòu)了草酸青霉纖維素酶表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò),獲得了高產(chǎn)突變株RE-10。進(jìn)一步在其中過表達(dá)p-葡萄糖苷酶,顯著改良了其酶系組成和酶解效率。此外,我們還在青霉屬真菌中首次功能鑒定了發(fā)育調(diào)控因子PoFlbC,并且在分子層面揭示了其共調(diào)控分生孢子發(fā)生和纖維素酶表達(dá)的機(jī)制。首次功能鑒定了絲狀真菌中的核小體重塑蛋白復(fù)合物組分RSCA,并對其參與的生物學(xué)過程進(jìn)行了相關(guān)研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q55;Q78
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本文編號：1579392