發(fā)布時(shí)間：2018-03-01 07:06

  本文關(guān)鍵詞： ATPR 誘導(dǎo)分化 維甲酸受體 雌激素受體 維甲酸受體誘導(dǎo)基因1　出處：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2013年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：全反式維甲酸(all trans retinoic acid，ATRA)作為誘導(dǎo)分化劑已廣泛應(yīng)用于急性早幼粒性細(xì)胞白血病的臨床治療，其能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞逐漸向正常細(xì)胞分化從而達(dá)到治愈腫瘤的目的，但同時(shí)也存在維甲酸綜合征和耐藥等不足。本實(shí)驗(yàn)室以ATRA為先導(dǎo)化合物，通過(guò)對(duì)其碳鏈末端極性基團(tuán)進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，合成了一系列全新的維甲酸衍生物，經(jīng)過(guò)體外藥效學(xué)篩選發(fā)現(xiàn)4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯(4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate, ATPR)具有較強(qiáng)的抗腫瘤增殖和誘導(dǎo)分化活性，，并已申請(qǐng)獲得自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)（專利公開(kāi)號(hào)：CN101591280、CN102008443A），有望開(kāi)發(fā)成為一種新型抗腫瘤藥。本研究以人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7為研究對(duì)象，體外觀察了ATPR對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖及分化的影響，并探討其作用的分子機(jī)制。 目的：本研究觀察新型維甲酸衍生物4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯(4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate, ATPR)對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖和分化的作用，并探討其作用的可能分子機(jī)制。 方法： 1.新型維甲酸類衍生物ATPR (終濃度分別為10~(-4)、10~(-5)、10~(-6)、10~(-7)、10~(-8)、10~(-9)9mol/L)作用于人乳腺癌MCF-7細(xì)胞后，通過(guò)MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況；細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；瑞氏-吉姆薩染色法在倒置相差顯微鏡下觀察加藥處理前后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；酶聯(lián)免疫法檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞分化標(biāo)志物粘蛋白(MUC-1)活性；流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞周期的變化。 2.選擇MCF-7細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，設(shè)空白對(duì)照組(加入等體積的DMEM)、溶劑對(duì)照組(含0.05%無(wú)水乙醇)、陽(yáng)性藥對(duì)照組ATRA (濃度為10~(-5)mol/L)及實(shí)驗(yàn)組ATPR (終濃度分別為10~(-5)、10~(-6)、10~(-7)、10~(-8)、10~(-9)mol/L)，采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)ATPR用藥72h后引起的細(xì)胞中維甲酸受體RARα，RARβ，RARγ、雌激素受體ERα，ERβ和維甲酸受體誘導(dǎo)基因1RRIG1mRNA表達(dá)的變化；采用Western Blot技術(shù)檢測(cè)ATPR用藥72h后引起的細(xì)胞中維甲酸受體RARα，RARβ，RARγ蛋白的表達(dá)變化。 3.采用RNA干擾技術(shù)，體外觀察siRNA序列靶向沉默MCF-7細(xì)胞RRIG1后6h加入ATPR (終濃度為10~(-5)mol/L)，對(duì)細(xì)胞內(nèi)ERs和MAPK通路相關(guān)蛋白(ERK1/2、p38)的影響。探究RRIG1在介導(dǎo)ATPR作用于MCF-7細(xì)胞中的作用。 結(jié)果： 1. ATPR(10~(-4)、10~(-5)、10~(-6)、10~(-7)、10~(-8)、10~(-9)mol/L)體外用藥可抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7的增殖，抑制作用于藥物作用48h后出現(xiàn)，72h后達(dá)峰值。且隨著劑量的增加，抑制效應(yīng)增強(qiáng)。ATPR濃度為10~(-4)mol/L時(shí)，藥物對(duì)細(xì)胞增殖的抑制效率明顯高于其他劑量組，且鏡下觀察發(fā)現(xiàn)MCF-7細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、凋亡。瑞氏-吉姆薩染色結(jié)果顯示ATPR(10~(-5)、10~(-6)、10~(-7)、10~(-8)、10~(-9)mol/L)體外用藥可誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞形態(tài)趨于成熟分化。與溶劑對(duì)照組比較，ATPR用藥組MCF-7細(xì)胞上清中MUC-1含量下降，以藥物濃度為10~(-5)mol/L時(shí)MUC-1含量下降最為顯著(P0.01)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示ATPR(10~(-5)、10~(-6)、10~(-7)、10~(-8)、10~(-9)mol/L)用藥后MCF-7細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞表達(dá)量增加，S期減少，細(xì)胞周期進(jìn)程受影響，細(xì)胞阻滯在G0/G1期。 2. ATPR(10~(-5)、10~(-6)、10~(-7)、10~(-8)、10~(-9)mol/L)、ATRA(10~(-5)mol/L)作用72h后，與溶劑對(duì)照組相比，MCF-7細(xì)胞中RARβ、ERβ、RRIG1mRNA表達(dá)量隨ATPR濃度的升高而增加，以藥物濃度10~(-5)mol/L增加最顯著(P0.05)；RARγ mRNA表達(dá)量隨ATPR濃度的升高而減少，同樣以藥物濃度10~(-5)mol/L增加最顯著(P0.05)；RARα、ERα mRNA表達(dá)量沒(méi)有明顯變化。Western blot結(jié)果同樣顯示與溶劑對(duì)照組相比，ATPR(10~(-5)mol/L)作用72h后，RARβ蛋白表達(dá)量增加(P0.05)，RARγ蛋白表達(dá)量降低(P0.05)，RARα蛋白表達(dá)量沒(méi)有明顯變化。 3.靶向沉默RRIG1基因6h后加入ATPR(10~(-5)mol/L)作用72h，RT-PCR結(jié)果顯示：siRNA+ATPR組與ATPR組相比，ERβ mRNA表達(dá)量顯著降低(P0.05)，ERα mRNA表達(dá)量沒(méi)有明顯變化。Western blot結(jié)果顯示：siRNA+ATPR組與ATPR組相比，p-ERK1/2蛋白表達(dá)量明顯增高(P0.05)，p-p38蛋白表達(dá)量明顯降低(P0.05)。 結(jié)論： 1.4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯ATPR(10~(-4)、10~(-5)、10~(-6)、10~(-7)、10~(-8)、10~(-9)mol/L)可抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7的增殖并誘導(dǎo)其分化程度增高。 2. ATPR抑制MCF-7細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其分化的機(jī)制可能與其調(diào)節(jié)維甲酸受體RARs和雌激素受體ERs平衡、上調(diào)RRIG1表達(dá)有關(guān)。 3. RRIG1基因?qū)Υ萍に厥荏w的調(diào)控作用可能通過(guò)調(diào)節(jié)MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)基因表達(dá)實(shí)現(xiàn)。
[Abstract]:All trans retinoic acid (all trans retinoic acid, ATRA) as inducer of differentiation has been widely used in clinical treatment of acute promyelocytic leukemia granulocytes, which can induce the tumor cells to normal cells to cure the tumor, but also the existence of retinoic acid syndrome and drug resistance of the shortage. The laboratory with ATRA as the lead compound, by the end of the carbon chain polar groups modified, a new series of retinoic acid derivatives were synthesized by in vitro pharmacodynamic screening found that 4- amino -2- three fluorine methyl phenyl retinoic acid ester (4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate ATPR) has strong anti-tumor activity and proliferation and differentiation. Have to apply for independent intellectual property rights (patent No.: CN101591280, CN102008443A), is expected to develop into a new anti-tumor medicine. In this study, human breast cancer cell line MC F-7 was used to observe the effect of ATPR on the proliferation and differentiation of breast cancer cells in vitro, and to explore the molecular mechanism of its effect.
Objective: To observe the effect of new retinoic acid derivative 4- amino -2- three fluoromethyl phenyl retinoic acid (4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate, ATPR) on proliferation and differentiation of human breast cancer MCF-7 cells, and to explore the possible molecular mechanism of its action.
Method錛

本文編號(hào)：1550885