hLCN6 （Human lipocalin 6）是附睪特異性分泌蛋白,它能與精子結(jié)合,對精子的成熟發(fā)揮著重要作用。為了探究應(yīng)用抗hLCN6單克隆抗體偶聯(lián)免疫磁珠技術(shù)分離混合細胞中精子的可行性,建立混合斑中精子細胞分離的新方法,制備了不同比例的精子-上皮細胞混合懸液及混合斑樣本,以生物素標記的hLCN6單克隆抗體孵育樣品,再用親和素包被的免疫磁珠捕獲分離精子細胞,提取精子DNA進行PCR-STR （Short tandem repeat）分型,同時以差異裂解法提取精子,比較兩者的差異。經(jīng)ELISA檢測,hLCN6單克隆抗體與抗原的親和力解離常數(shù)（Kd）為3.47×10^–9 mol/L。免疫印跡和免疫熒光結(jié)果顯示,hLCN6在精子中可檢測到,主要定位于精子頭部的頂體后區(qū)域,但不能在上皮細胞中檢測到。hLCN6抗體偶聯(lián)的免疫磁珠復合物能夠?qū)崿F(xiàn)精子細胞的捕獲和分離,顯微鏡觀察顯示免疫磁珠能夠與精子頭部特異性結(jié)合。對精子個數(shù)為10³/mL的混合懸液,STR分型成功率（正確分型13個以上,RFU>200）為90%。當精子數(shù)量≥10⁴

【文章來源】：生物工程學報. 2019,35(01)北大核心CSCD

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抗hLCN6mAb親和力測定Fig.1Affinityassayofanti-hLCN6mAb.

ISSN1000-3061CN11-1998/Q生物工程學報ChinJBiotechhttp://journals.im.ac.cn/cjbcn154圖1抗hLCN6mAb親和力測定Fig.1Affinityassayofanti-hLCN6mAb.圖2Westernblotting檢測hLCN6在精子及口腔上皮細胞的表達Fig.2WesternblottinganalysisofhLCN6expressioninspermatozoaandbuccalepithelialcells.1:buccalepithelialcells;2:spermatozoa.2.3hLCN6的精細胞定位用純化的抗hLCN6mAb對精子進行免疫熒光染色，結(jié)果顯示，在精子頭部的頂體后區(qū)域出現(xiàn)明顯的熒光信號(圖3)，證明hLCN6蛋白主要分布在精子頭部，這與之前文獻報道一致。與hLCN6蛋白結(jié)合的精子陽性率為(90±5)%(n=6)。而對照抗體染色的精細胞頭部為陰性。2.4Anti-hLCN6IMBs捕獲精子情況將生物素標記的抗hLCN6mAb包被IMBs，與細胞混合懸液進行孵育，充分洗滌后將樣品制備成涂片進行顯微觀察。顯微鏡下見精子結(jié)構(gòu)完整，每個精子可結(jié)合多個磁珠，主要結(jié)合在精子頭部(圖4)。鏡下未檢測到口腔上皮細胞。圖3抗hLCN6mAb的免疫熒光染色分析Fig.3Immunofluorescenceanalysisofanti-hLCN6mAbstaininginspermcells.(A)Immunofluorescentstainingofspermatozoawithanti-hLCN6mAb.(B)ControlimmunofluorescentstainingofspermatozoawithnormalmouseIgG.(C,D)Spermcellsobservedunderalightmicroscope.圖4顯微鏡觀察anti-hLCN6IMBs捕獲精子情況Fig.4Opticalmicroscopyimageforintact(A)andtail-lostspermcell(B)capturedbyanti-hLCN6IMBs(400×).2.5IMB法和差異裂解法分離精子DNA分型檢測情況為了檢測anti-hLCN6IMBs分離精子的效率和靈敏度，制備了

ISSN1000-3061CN11-1998/Q生物工程學報ChinJBiotechhttp://journals.im.ac.cn/cjbcn154圖1抗hLCN6mAb親和力測定Fig.1Affinityassayofanti-hLCN6mAb.圖2Westernblotting檢測hLCN6在精子及口腔上皮細胞的表達Fig.2WesternblottinganalysisofhLCN6expressioninspermatozoaandbuccalepithelialcells.1:buccalepithelialcells;2:spermatozoa.2.3hLCN6的精細胞定位用純化的抗hLCN6mAb對精子進行免疫熒光染色，結(jié)果顯示，在精子頭部的頂體后區(qū)域出現(xiàn)明顯的熒光信號(圖3)，證明hLCN6蛋白主要分布在精子頭部，這與之前文獻報道一致。與hLCN6蛋白結(jié)合的精子陽性率為(90±5)%(n=6)。而對照抗體染色的精細胞頭部為陰性。2.4Anti-hLCN6IMBs捕獲精子情況將生物素標記的抗hLCN6mAb包被IMBs，與細胞混合懸液進行孵育，充分洗滌后將樣品制備成涂片進行顯微觀察。顯微鏡下見精子結(jié)構(gòu)完整，每個精子可結(jié)合多個磁珠，主要結(jié)合在精子頭部(圖4)。鏡下未檢測到口腔上皮細胞。圖3抗hLCN6mAb的免疫熒光染色分析Fig.3Immunofluorescenceanalysisofanti-hLCN6mAbstaininginspermcells.(A)Immunofluorescentstainingofspermatozoawithanti-hLCN6mAb.(B)ControlimmunofluorescentstainingofspermatozoawithnormalmouseIgG.(C,D)Spermcellsobservedunderalightmicroscope.圖4顯微鏡觀察anti-hLCN6IMBs捕獲精子情況Fig.4Opticalmicroscopyimageforintact(A)andtail-lostspermcell(B)capturedbyanti-hLCN6IMBs(400×).2.5IMB法和差異裂解法分離精子DNA分型檢測情況為了檢測anti-hLCN6IMBs分離精子的效率和靈敏度，制備了

【參考文獻】：
期刊論文
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[6]金黃地鼠腹側(cè)前列腺來源蛋白結(jié)合精子表面的實驗研究[J]. 駱建民,鄭玉鸞,周元聰,柯慧心,周白菡.  中華男科學雜志. 2007(10)



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