發(fā)布時間：2015-03-15 21:41

第一章研究背景

短串聯(lián)重復序列（Short Tandem Repeats，STRs)廣泛分布于人類基因組中，重復序列為2~6bp,重復次數(shù)從數(shù)次到數(shù)十次不等，其片段長度大多在400bp以下。STRs基因座以高靈敏度、高特異性以及標準化分型等特點成為了目前法醫(yī)DNA分析中的主要遺傳標記[1]。最早發(fā)現(xiàn)的STR序列是由TG串聯(lián)重復組成的長度可變序列。絕大多數(shù)STR序列位于非編碼區(qū)，極少數(shù)分布在基因組的編碼區(qū)域。STR擴增片段長度一般為100bp-400bp之間，聯(lián)合檢測：10-13個STR基因座，平均匹配概率可以達到10-9,具有很高的個體識別能力。從實際應用價值來看，用于法醫(yī)學領域的STR基因座應具備擴增長度相對較短，較高的雜合度，有規(guī)律的4個或5個核苷酸重復，突變率低以及高度種屬特異性等特點。在大多數(shù)法醫(yī)DNA檢驗的實際案件中，所得到的現(xiàn)場檢材往往很多都已腐敗，甚至是高度腐敗，在此類法醫(yī)學檢材中DNA分子受到損害，DNA鏈發(fā)生斷裂，使DNA分子的完整性受到極大破壞。應用STRs分型會出現(xiàn)基因漏擴或優(yōu)勢擴增等現(xiàn)象，影響最終的分型結果，從而給法醫(yī)學實際應用帶來極大的困難。
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第二章在痕量DNA中SNaPshot檢測ABO血型方法的構建與優(yōu)化

2.1材料和方法
在案件缺乏足夠信息使得偵破工作陷入停頓時，通過法醫(yī)物證學相關的技術手段分析與表型相關的DNA突變，進而獲得與表型相關的體征信息，可以有效地縮小拉網式排查范圍，為案件的早日突破提供積極的幫助。ABO血型是重要的人類遺傳表征，在法醫(yī)物證研究領域作為第一代常規(guī)法醫(yī)學檢測項目被廣泛應用，對ABO血型的檢測方法己從最初的血清學反應發(fā)展到了 DNA檢測的階段。目前，絕大多數(shù)法醫(yī)學實驗室都能夠通過對DNA進行分析得到較為可靠的ABO血型分型結果，這為無血痕案件的偵破提供了重要線索。在前期的文獻檢索中發(fā)現(xiàn)：Doi Y.等利用位于ABO基因上的6個SNPs位點構建了一種基于SNPs位點的血型檢測方法，并從靈敏度以及物種特異性等方面對該方法進行了全面的評估[38]。

2.2實驗結果
在本章中，完成了對10份指紋上皮脫落細胞的WGA擴增，并進行ABO血型的SNaPshot檢測，以口腔拭子作為陽性對照，所有10份樣品均得到檢出，其結果與血清學檢測一致，說明參考文獻的方法適用于痕量指紋上皮脫落細胞DNA檢材。在整個實驗過程中發(fā)現(xiàn)了一些需要注意的操作步驟，具體討論如下：1)痕量DNA模板的提取與WGA擴增污染是偶然意外的物質進入了法醫(yī)學樣本，從而影響DNA證據(jù)的識別與認定。這些污染物可能是生物性的或是非生物性的，外源性污染既對法醫(yī)學樣本產生影響，也對最終的鑒定結果產生影響。從法醫(yī)物證學的角度看，若污染是來自于人的生物物質，比如上皮脫落細胞，這種類型的污染會直接影響到最終的DNA證據(jù)，嚴重影響到該法醫(yī)學證據(jù)的證明價值，甚至會導致錯誤結論，從而導致嚴重的社會影響及公眾對司法的信心。

第二章在痕量DNA中SNaPshot檢測ABO血型方法的構建與優(yōu)化..... 25

2.1材料和方法........ 27

第三章在痕量DNA中SNaPshot檢測ABO血型方法的應用評估...... 47

3.1材料與方法...... 47

3.2實驗結果.......... 48

3.3實驗討論..... 62

第四章總結與展望...... 64

第三章在痕量DNA中SNaPshot檢測ABO血型方法的應用評估

3.1材料與方法
GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification Kit (Sigma, U.S.)，ABIPRISMSNaPshotMaitiplexKit (AppliedBiosystems, U.S.)，EasyTaqDNApolymerase(北京 TansGen 公司），Alkaline Phosphatase(Shrimp) (Takara (大連）公司），ExonucleaseI (Takara (大連）公司），通用型DNA純化回收試劑盒（天根生物技術公司，北京），GeneScan?-120 LIZ Size Standard (Applied Biosystems，U.S.)，Hi-DiFormamide ( Applied Biosystems, U.S.)，BigDye Terminator v3.1(Applied Biosystems，U.S.)，POP4 液體膠（Applied Biosystems，U.S.), NaCl(Sigma,U.S.) MgCkCSigma,U.S.)，Tris(Sigma, U.S.)，Tween-20(Sigma, U.S.),NP40 (Sigma, U.S.), ChelexlOO (Bio-Red, U.S.)；主要儀器.

3.2實驗結果
在收集到的48份樣品中，血清學檢測的結果是A型16份，B型11份，0型18份，AB型3份。對48份樣品使用SNaPshot技術進行ABO血型基因型分型，全部48份指紋上皮脫落細胞均得到檢出，47份口腔拭子得到檢出（第32號樣品的口腔拭子由于操作失誤在處理過程中損失）。檢出的47份結果能夠完全匹配。其具體數(shù)據(jù)為：在血清學判定為A型的16份樣品中AA型3份，AOA型4份，A0°型9份；在血清學判定為B型的11份樣品中BB型1份,BQA型9份，，BQG型1份；在血清學判定為?型的18份樣品中QAQA型7份，QGQG型2份，OAQG型9份；在血清學判定為AB型的3份樣品中AB型3份。
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第四章總結與展望

隨著身份認證及表型相關的SNPs技術體系的構建，法醫(yī)物證學中一個“DNA智能化”的新時代正在拉幵序幕。隨著從現(xiàn)場采集到的法醫(yī)學檢材中使用SNPs預測可見特征（Externally Visible Characteristics, EVC )的能力日益增強，通過EVC預測對嫌疑人的相貌進行“DNA畫像”為警方尋找嫌疑人提供有力幫助，特別是遇到常規(guī)DNA擴增技術無法使用的情況，在面對一些“冰凍案件”時可以有效的縮小拉網排查的范圍。隨著司法實踐的不斷深入、檢測技術手段的不斷改進和法醫(yī)物證學數(shù)據(jù)的不斷積累，特別是全球范圍內諸多法醫(yī)學實驗室不斷加強技術合作，積累到不同地區(qū)的法醫(yī)學SNPs分型數(shù)據(jù)，在不久的將來基于SNPs的法醫(yī)學數(shù)據(jù)庫構建將會從提議變?yōu)楝F(xiàn)實，為法醫(yī)物證學提供新的工具。

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參考文獻（略）

本文編號：17981