第 1 章 緒論

1.1 AA 研究進(jìn)展
AA是一種用于制造塑料的化工原料，為已知的致癌物。AA是油炸食品中的常見危害物質(zhì)，目前，人們的日常食品中很大一部分是油炸食品，因此，對(duì)油炸食品中AA進(jìn)行研究也就必要而迫切，這有助于增強(qiáng)公眾認(rèn)識(shí)及保證居民身體健康。2002年，瑞典學(xué)者發(fā)現(xiàn)，富含淀粉的食物在經(jīng)過120℃或更高溫度油炸或燒烤等處理過程后會(huì)檢測(cè)到有毒物質(zhì)AA。隨后挪威、瑞士、英國(guó)、美國(guó)等國(guó)的研究人員也發(fā)現(xiàn)了這一問題，AA問題已經(jīng)引起了國(guó)際社會(huì)的高度重視[1]。
1.1.1 AA 的性質(zhì)
AA是一種構(gòu)造單一的的物質(zhì)，化學(xué)式為CH2=CHCONH2。AA是聚丙烯酰胺合成中的中間物質(zhì)，AA在常溫下以白色晶體形式存在，AA在熔點(diǎn)時(shí)易聚合，也會(huì)發(fā)生聚合反應(yīng)。在酸中較在堿中穩(wěn)定，在紫外光照射易聚合。將AA置于熱的溶劑中，會(huì)釋放出劇烈的腐蝕性氣體和氮的氧化物類物質(zhì)[2]。AA主要用作制造水溶性高分子聚合物，常被用于多種化工生產(chǎn)途徑[3]。研究表明，油炸、烘烤類等含高淀粉的食品中AA含量特別高，一些兒童食品中也廣泛存在較高水平的AA[4]。
1.1.2 AA 的毒性及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究
2005年2月，聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織聯(lián)合食品添加劑專家委員會(huì)研究證實(shí)AA具有神經(jīng)、遺傳和生殖毒性，并被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)定義為人類可能致癌物。AA也會(huì)對(duì)肝臟和神經(jīng)產(chǎn)生作用，同時(shí)還具有生殖毒性，對(duì)DNA具有損傷作用，另外還會(huì)對(duì)嚙齒類動(dòng)物產(chǎn)生致癌作用。周繼等[5]的研究發(fā)現(xiàn)，急性經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)灌胃后觀測(cè)兩周，未見大量的中毒及死亡情況；Ames試驗(yàn)結(jié)果為陰性；大鼠精子畸形試驗(yàn)3個(gè)不同濃度梯度的精子畸形率分別是2.21%、2.54%、1.98%，結(jié)果與陰性對(duì)照組類似，差異不明顯，陽性對(duì)照組畸形率為11.25%，結(jié)果顯著高于各實(shí)驗(yàn)組(p<0.01)；18個(gè)月喂養(yǎng)試驗(yàn)未見動(dòng)物死亡。機(jī)體會(huì)從消化道、呼吸道、皮膚黏膜等接觸到AA。AA進(jìn)入機(jī)體后會(huì)以多種方式被攝取，胃腸道的吸收是最快的方式。進(jìn)入體內(nèi)的AA絕大部分被代謝，僅少量經(jīng)尿液排出[6]。AA較易被機(jī)體利用，引發(fā)急性、亞急性和慢性中毒[7]，引起周圍和中樞神經(jīng)的損壞病變、肌肉無力、后肢麻木和運(yùn)動(dòng)能力降低等狀況[8]。除了會(huì)通過職業(yè)性接觸AA，普通居民可經(jīng)飲食和吸煙接觸到AA，所以在平時(shí)烹調(diào)食品時(shí)，要遵循科學(xué)的方法。此外還要限制AA在膳食中的攝入量，少吃油炸類食品，健康飲食。
1.1.3 食品中 AA 的形成機(jī)制
淀粉含量高的食品在經(jīng)過高溫烘焙（＞120℃）或煎炸時(shí)，其中的還原糖會(huì)與天冬酰胺發(fā)生反應(yīng)生成AA，AA的含量會(huì)隨著加工溫度的升高而呈上升趨勢(shì)。可是在熱處理食物過程中生成AA的途徑還沒有徹底闡明，可能參與反應(yīng)的物質(zhì)包括糖類、蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪以及其它的食品物質(zhì)。
食品中AA的形成機(jī)理，目前廣泛認(rèn)為是由于在食品的加工過程中，以天冬酰胺和羰基化合物為原料所發(fā)生的美拉德反應(yīng)過程中產(chǎn)生的[9-10]。Stadler等把多種氨基酸在超過100℃的溫度下獨(dú)自加熱一段時(shí)間，結(jié)果顯示，僅僅谷氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸和蛋氨酸等生成了少量AA；當(dāng)把天冬酰胺和還原糖混合時(shí)，經(jīng)高溫處理后，在產(chǎn)物中可檢測(cè)到很多AA。因此斷定，天冬酰胺和還原糖在加熱處理后發(fā)生美拉德反應(yīng)形成AA。美拉德反應(yīng)也被稱為非酶褐變反應(yīng)，它受反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度和酸堿度等條件影響。在反應(yīng)過程當(dāng)中還原糖的羰基和氨基化合物縮和形成了糖胺，之后發(fā)生發(fā)生分子重排、脫水和脫羥基，形成多種小分子的糖分解及降解衍生物，如呋喃、呋喃酮化合物及其衍生物等。隨后這些產(chǎn)物與其他氨基酸、醛、H2S、NH3發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生食物特有的香氣物質(zhì)。AA就是天門冬氨酸和葡萄糖反應(yīng)生成N-(D-葡萄糖-yl)-L-天門冬氨酸，在加熱后雜環(huán)化合物分裂脫CO2釋放了AA[11]。
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1.2 HMF 研究進(jìn)展
1.2.1 食品中的羥甲基糠醛（HMF）
羥甲基糠醛，也稱為5 -羥甲基糠醛[20]，是重要的工業(yè)生產(chǎn)用物質(zhì)，化學(xué)結(jié)構(gòu)為：

因?yàn)镠MF含有一個(gè)醛基和一個(gè)羥甲基，可發(fā)生多種化學(xué)反應(yīng)，可用做生產(chǎn)用途廣泛的化合物和新型材料。
HMF的生成量受到pH 值、壓力、溫度和食物組成等的影響，當(dāng)上述反應(yīng)條件發(fā)生變化時(shí)，非還原糖會(huì)轉(zhuǎn)變成為還原糖或多酚，進(jìn)而影響糠醛生成的過程，通過調(diào)節(jié)這些反應(yīng)條件可以高效地控制糠醛生成的進(jìn)度[21]。
在熱處理和發(fā)酵等加工過程中會(huì)有HMF的生成，其主要的生成方式是加工時(shí)所發(fā)生的美拉德和焦糖化反應(yīng)。HMF主要分布在易于發(fā)生美拉德和糖降解反應(yīng)的食物中，如酒類、 醬油、 烘焙食品和植物油等，其含量是探究食物在加工儲(chǔ)藏過程中質(zhì)量變化以及評(píng)價(jià)相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量?jī)?yōu)劣的一項(xiàng)關(guān)鍵指標(biāo)。研究表明HMF具有多方面的生理作用，食用過量可能對(duì)人體健康造成傷害[22]。
HMF 的另外一個(gè)來源是食品中添加的焦糖或蜂蜜等物質(zhì)[23]。目前，研究者對(duì)HMF 檢測(cè)的研究，主要集中在檢測(cè)蜂蜜[24]、醋[25]、牛乳[26]、酒類[27]等各類食品中HMF的含量。Rada-Mendoza[28,29]等研究了38種含有水果和糖的果醬，以及18種以水果為基料的嬰兒食品的pH值、干物質(zhì)含量和HMF的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有的56種樣品中都含有HMF，檢測(cè)結(jié)果從痕量到7.17mg 100g-1不等，平均含量1.35mg 100g-1。盡管在某些系列的食品中，如干制水果、焦糖、醋中的HMF 含量相當(dāng)高，但是面包和咖啡是HMF的最主要膳食攝入方式[30]。
1.2.2 HMF 的形成機(jī)理
HMF是一種糖的加熱分解衍生物[22]，在高壓滅菌過程當(dāng)中或糖含量較高的食物，例如蜂蜜、甜酒、甜面醬等[31]的保存中，都會(huì)產(chǎn)生HMF[32]。廣泛認(rèn)為單糖是發(fā)生糠醛反應(yīng)的原始底物，然而也不斷有相關(guān)地結(jié)果發(fā)表了不同的意見，在高于250℃的溫度下焙烤餅干，若用蔗糖替換葡萄糖或果糖，就會(huì)有大量的HMF生成[33]，這可能是因?yàn)檎崽窃谳^高溫度下生成了高活性的呋喃果糖基離子引起的[34]。
在HMF的生成過程中，加工溫度和壓力是非常重要的影響因素[35]。高溫與壓力都會(huì)加速反應(yīng)速度，因?yàn)樵谶@種條件下，烯醇縮合和有關(guān)的水解和脫水反應(yīng)均相對(duì)易于發(fā)生[36]。此外，pH值也會(huì)影響HMF的生成，研究表明當(dāng)面團(tuán)的pH值升高時(shí)，HMF含量降低[37]。微波加熱能夠增加HMF的含量[38]，在微波的電場(chǎng)中，酮糖是六碳糖的主要存在形式，這種形式對(duì)HMF的形成十分有利[39]。
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第2章 測(cè)定食品中HMF含量的超高速液相色譜法分析方法

許多食物經(jīng)熱處理和發(fā)酵等加工程序后會(huì)生成HMF，主要來自于加工過程中所發(fā)生的美拉德反應(yīng)(Maillard reaction)及焦糖化反應(yīng)[62-64]。HMF將在達(dá)到一定濃度時(shí)對(duì)人體造成傷害[65]。HMF的含量會(huì)在熱加工過程中逐漸升高，所以HMF的濃度常被用于評(píng)價(jià)褐變反應(yīng)強(qiáng)度和食品最終品質(zhì)[66]。目前，對(duì)于食品中HMF的測(cè)定還主要是基于經(jīng)典色譜技術(shù)的方法，LC-MS, LC-MS/MS和GC-MS都是常用的測(cè)定方法[67-70]，但最普遍的測(cè)定方法是液相色譜配以紫外檢測(cè)器來測(cè)定食品中的HMF[71]，這些方法的分析時(shí)間都較長(zhǎng)，并且敏感度不高。UHPLC方法是目前色譜分離技術(shù)的最新發(fā)展[72]。UHPLC的特性使其在應(yīng)用上更具優(yōu)勢(shì)。因?yàn)閁HPLC方法中色譜柱的體積更小，所以在較高的柱壓下，流動(dòng)相可以采用較小的流速。同時(shí)還具有高速、高分辨率和高敏感性的特點(diǎn)。和紫外檢測(cè)器相比，PDA檢測(cè)器具有實(shí)時(shí)輸出三維圖像和色譜圖的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)色譜圖具有更加純的峰和更高的分辨率[73-75]。
本章實(shí)驗(yàn)采用UHPLC-PDA方法，測(cè)定不同種類的中國(guó)傳統(tǒng)食品中HMF含量，旨在探討不同的食品原料和加工方式對(duì)食品中HMF含量的影響。另外，對(duì)比中國(guó)居民營(yíng)養(yǎng)與健康現(xiàn)狀數(shù)據(jù)[76]，對(duì)中國(guó)居民日常膳食中HMF的曝露量進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)。

2.1 材料與儀器
2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
羥甲基糠醛（HMF，純度>99%），購(gòu)于Sigma公司；乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、正己烷、色譜純甲醇：北京化學(xué)試劑公司；0.45μm過濾膜、超純水。
2.1.2 儀器與設(shè)備
UHPLC-30A超高速液相色譜儀（島津）；
GDYQ-704S 快速粉碎機(jī)：慈溪市寧匯電器有限公司；
漩渦混勻器：北京北德科學(xué)器材有限公司；
L800離心機(jī)：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；
ULTRASONS-H超聲清洗器：西班牙abrera公司。
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2.2 超高速液相色譜法測(cè)定食品中 HMF 含量
2.2.1 樣品處理
實(shí)驗(yàn)中227種食品均購(gòu)買于長(zhǎng)春各大超市和商店，共分為12個(gè)種類，分別為：傳統(tǒng)西式谷物食品、傳統(tǒng)中式谷物食品、海苔、調(diào)味料、巧克力、可樂、茶葉、土豆制品、水果和蔬菜制品、蜂蜜制品、咖啡和嬰兒食品等。
將樣品粉碎后，，精確量取1.00g樣品置于15mL離心管中，加入9mL去離子水，旋轉(zhuǎn)振蕩1min使樣品和水充分混合，之后再超聲10min以有利于HMF充分析出。分別加入0.5mL卡式試劑I和 II，同時(shí)加入1.0mL正己烷，振蕩混合，離心10min，取上層澄清液過膜備用[70,77]。
2.2.2 超高速液相色譜分析方法
實(shí)驗(yàn)儀器為島津UHPLC-30A，配備脫氣裝置、自動(dòng)進(jìn)樣器、高壓泵和PDA檢測(cè)器；柱子型號(hào)為Shim-pack柱(2.0×50 mm ID，島津，日本)；流動(dòng)相為水和甲醇(95:5)；流速為0.3 mL min 1；柱溫為30 °C；進(jìn)樣量為5μL。檢測(cè)器波長(zhǎng)為283nm。實(shí)驗(yàn)中所有樣品重復(fù)測(cè)定三次。
2.2.3 中國(guó)食品中 HMF 的暴露量的初步分析
根據(jù)中國(guó)居民營(yíng)養(yǎng)與健康現(xiàn)狀，將實(shí)驗(yàn)中的227中傳統(tǒng)食品根據(jù)不同的攝入量分為不同門類。日常HMF攝入量計(jì)算如下:

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第 3 章 富脂模擬反應(yīng)體系中油脂氧化對(duì) AA 和 HMF 形成的影響..............................18
3.1 鮮切薯片油炸過程中油脂氧化產(chǎn)物對(duì) AA 形成的貢獻(xiàn)率研究 ..........................18
3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料.....................................18
3.1.2 實(shí)驗(yàn)方法....................................18
3.1.3 結(jié)果與討論.............................20
3.2 富脂模擬反應(yīng)體系中油脂氧化對(duì) AA 形成的影響 ...................................27
3.2.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器...............................27
3.2.2 實(shí)驗(yàn)方法......................................27
3.2.3 結(jié)果與討論....................................27
3.3 富脂模擬反應(yīng)體系中油脂氧化對(duì) HMF 形成的影響初探 ........................36
3.3.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器..................................36
3.3.2 實(shí)驗(yàn)方法....................................36
3.3.3 結(jié)果與討論................................37
3.4 本章小結(jié)...................................38

第四章 全文創(chuàng)新點(diǎn)

(1) 建立了薯片中AA的預(yù)測(cè)模型，可以快速有效的對(duì)薯片中的AA含量進(jìn)行預(yù)測(cè)分析；
(2) 建立富脂模擬體系，排除食品成分的干擾，單純考察了油脂氧化對(duì)AA形成的影響；
(3) 建立了Glu/Asn模擬體系，考察了油脂氧化產(chǎn)物對(duì)HMF形成的影響。
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第五章 結(jié)論

5.1 全文結(jié)論
AA是第二類致癌物，AA的污染問題已經(jīng)引發(fā)了國(guó)際社會(huì)和各國(guó)政府的高度關(guān)注。HMF是美拉德反應(yīng)中后期生成的一種典型化合物。研究表明，HMF具有細(xì)胞毒性，同時(shí)還會(huì)對(duì)眼和上呼吸道黏膜具有刺激性。在經(jīng)過熱處理后，食品中HMF醛的含量會(huì)呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)，因此，HMF經(jīng)常被用于評(píng)價(jià)食品非酶褐變反應(yīng)程度和食品最終品質(zhì)的工具。
(1) 建立超高速液相色譜法對(duì)227種食品中HMF進(jìn)行了測(cè)定。方法學(xué)評(píng)價(jià)參數(shù)如精密度、線性度和準(zhǔn)確度等均較為理想。實(shí)驗(yàn)中所選食品中絕大多數(shù)都含有HMF。日常膳食中，HMF主要攝入途徑為大米和面粉制品；
(2) 在油炸薯片中，測(cè)定不同油炸時(shí)間和溫度下的AA含量。AA含量會(huì)隨著油炸溫度和時(shí)間的升高而增加。丙酮醛值和過氧化值顯著影響AA的生成，茴香胺值的影響次之，水分含量的影響最小。分析得到的預(yù)測(cè)模型為：AA含量=－0.200－0.00136×水分含量+0.32995×過氧化值+0.07367×茴香胺值+0.1032×丙酮醛值。
(3) 預(yù)氧化模擬體系中，AA含量會(huì)隨著油炸溫度和預(yù)加熱時(shí)間的增加而增大。在相同的模擬體系中，豆油中生成的AA要比橄欖油和棕櫚油多。過氧化值顯著影響AA的生成，茴香胺值和羰基價(jià)的影響最小。
(4) 在Glu/Asn模擬體系中添加MG、乙二醛和丁二酮來研究油脂氧化產(chǎn)物對(duì)HMF形成的影響。其中，MG對(duì)于HMF的生成產(chǎn)生的影響最大，可以初步斷定油脂氧化會(huì)對(duì)HMF的生成產(chǎn)生影響。
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參考文獻(xiàn)（略）