【摘要】：目的胃腸動(dòng)力障礙是FD的主要病理生理基礎(chǔ),而ENS被稱為“腸腦”,可不依賴中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)消化系統(tǒng)胃腸的運(yùn)動(dòng)、分泌、吸收、感覺(jué)和血液循環(huán)等功能。GDNF作為神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子之一,可促進(jìn)發(fā)育中神經(jīng)元的增殖、分化、成熟和遷移,對(duì)出生后成熟神經(jīng)元的存活也具有重要作用,可調(diào)節(jié)成熟的ENS神經(jīng)元表達(dá)。GDNF是膜外蛋白,需與受體GFR-α1特異性結(jié)合后,與RET受體相互作用,從而激活ERK、PI3K等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。ERK信號(hào)通路是GDNF下游比較經(jīng)典的信號(hào)通路,在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中處于樞紐地位,已有文獻(xiàn)表明證明pERK1/2蛋白水平在FD大鼠中異常升高。本研究以FD模型大鼠為研究對(duì)象,觀察FD大鼠不同時(shí)期和胃竇與十二指腸不同部位ENS及GDNF下游ERK信號(hào)通路的變化。并以電針為干預(yù)手段,研究電針對(duì)FD模型大鼠ENS的影響,同時(shí)應(yīng)用MEK抑制劑U0126,從GDNF與MEK/ERK信號(hào)通路的視角分析其相關(guān)機(jī)制。方法實(shí)驗(yàn)一,選用SPF級(jí)健康成年雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠40只。隨機(jī)分為正常組(n=10)及FD組(n=30),FD組又按病程分為FD2周組,FD3周組、FD4周組,10只/組。正常組常規(guī)飼養(yǎng),FD不同病程的3組采用夾尾刺激(30min/次,2次/天)+不規(guī)則飲食(隔日進(jìn)食)的復(fù)合造模方法建立FD模型。按照FD病程的不同,造模時(shí)間分別持續(xù)2周、3周、4周。取各組大鼠胃竇與十二指腸組織,用Western Blotting(WB)分別檢測(cè)胃竇與十二指腸組織PGP9.5、s100β、GFAP、GDNF、pMEK蛋白水平,透射電鏡觀察EGCs的超微結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)二、三、四、五,選用SPF級(jí)健康成年雄性SD大鼠60只。隨機(jī)分為正常組(n=10)及造模組(50只)。造模組大鼠按夾尾刺激+不規(guī)則飲食的復(fù)合造模方法建立FD模型,FD模型大鼠病程為2周。將造模成功的40只大鼠隨機(jī)分為模型組、電針組、抑制劑組、電針+抑制劑組,10只/組。分組完成后,電針組大鼠針刺雙側(cè)足三里穴,針刺后接韓氏電針儀,電針參數(shù)為連續(xù)波,頻率2Hz,電流強(qiáng)度為1mA,每日1次,連續(xù)10天。抑制劑組大鼠用U0126以0.3mg/kg劑量腹腔注射,1次/天,共10天。電針+抑制劑組腹腔注射U0126,方法及劑量同抑制劑組,30min后再電針足三里穴,過(guò)程同電針組。每日觀察并記錄大鼠一般狀態(tài),測(cè)量大鼠體重。在電針干預(yù)10天后,大鼠禁食不禁水24h,營(yíng)養(yǎng)性半固體糊1g/100g灌胃,灌胃30min后,予以10%水合氯醛(0.35mL/100g)腹腔注射依次麻醉大鼠。剖開(kāi)腹腔,進(jìn)行胃排空和小腸推進(jìn)試驗(yàn)。取下大鼠胃竇及十二指腸組織,應(yīng)用HE染色光鏡下觀察胃竇與十二指腸組織的形態(tài)學(xué)變化;運(yùn)用電鏡觀察大鼠胃竇與十二指腸組織EGCs的超微結(jié)構(gòu);免疫熒光染色檢測(cè)胃竇與十二指腸組織s100β蛋白水平及整體分布情況;WB檢測(cè)大鼠胃竇與十二指腸組織PGP9.5、GFAP、s100β、GDNF、GFRα1、RET、pMEK、pERK1/2蛋白表達(dá);免疫組化檢測(cè)胃竇與十二指腸組織GDNF蛋白水平及整體分布情況;PCR檢測(cè)大鼠胃竇與十二指腸組織PGP9.5、GFAP、s100β、GDNF mRNA水平。結(jié)果1.FD大鼠ENS及GDNF/ERK信號(hào)通路的變化FD不同病程的三組大鼠胃竇與十二指腸組織PGP9.5蛋白表達(dá)較正常組下降(均P0.01);在FD不同病程的三組中,FD4周組大鼠胃竇與十二指腸組織PGP9.5蛋白水平最低,低于FD3周組(均P0.05)、FD2周組(均P0.01);FD2周組胃竇與十二指腸組織PGP9.5蛋白水平明顯高于FD3周組(均P0.05)。各組大鼠s100β蛋白表達(dá)變化如下。FD不同病程的3組大鼠胃竇與十二指腸組織s100β蛋白水平較正常組顯著增加(均P0.01);FD4周組大鼠胃竇與十二指腸組織s100β蛋白水平明顯高于FD2周組(均P0.01)、FD3周組(均P0.05);FD2周組胃竇與十二指腸組織S100β蛋白水平較FD3周組明顯減少(均P0.05)。FD2周組、FD3周組、FD4周組3組大鼠胃竇與十二指腸組織GFAP蛋白水平較正常組明顯上升(均P0.01);FD不同病程的3個(gè)組中,FD4周組大鼠胃竇與十二指腸組織GFAP蛋白量最高,高于FD2周組(均P0.01)、FD3周組(均P0.05);而FD3周組大鼠胃竇與十二指腸組織GFAP蛋白表達(dá)較FD2周組明顯增加(均P0.05)。透射電鏡顯示正常組大鼠神經(jīng)纖維周?chē)恼GCs結(jié)構(gòu),細(xì)胞呈不規(guī)則星形,胞核形態(tài)不規(guī)則,胞核中常染色質(zhì)較多,異染色質(zhì)較少,核周?chē)植加性S多大小不等呈圓形或橢圓形的無(wú)髓神經(jīng)纖維軸索,軸索附近含有少量的線粒體,還可見(jiàn)軸索中分布的神經(jīng)絲,胞質(zhì)中其他細(xì)胞器較少。FD模型大鼠可見(jiàn)受損的EGCs超微結(jié)構(gòu),EGCs細(xì)胞核中異染色質(zhì)增多,染色質(zhì)濃縮,線粒體腫脹,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張。FD2周組、FD3周組、FD4周組大鼠胃竇與十二指腸組織GDNF蛋白水平較正常組明顯上升(均P0.01);FD4周組胃竇與十二指腸組織GDNF蛋白水平最高,明顯高于FD2周組(均P0.01)、FD3周組(均P0.05);與FD2周組比較,FD3周組大鼠胃竇與十二指腸組織GDNF蛋白水平明顯增加(均P0.05)。FD2周組、FD3周組、FD4周組大鼠胃竇與十二指腸組織pMEK蛋白水平較正常組明顯增加(均P0.01);FD2周組胃竇與十二指腸組織pMEK蛋白水平低于FD3周組(胃竇P0.05,十二指腸P0.01)、FD4周組(均P0.01);與FD3周組比較,FD4周組大鼠胃竇與十二指腸組織pMEK蛋白水平明顯增加(胃竇P0.05,十二指腸P0.01)。2.電針FD大鼠組織形態(tài)學(xué)、胃腸動(dòng)力學(xué)的影響模型組、電針組、抑制劑組、電針+抑制劑組大鼠經(jīng)過(guò)造模后體重較正常組顯著降低(均P0.01),且模型組、電針組、抑制劑組、電針+抑制劑組四組間兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義(P0.05)。給予各組不同的干預(yù)后,模型組大鼠的體重與正常組相比仍明顯降(P0.01);與模型組相比,電針組、抑制劑組、電針+抑制劑組大鼠體重明顯增加(均P0.01);電針+抑制劑組大鼠體重高于電針組(P0.05)及抑制劑組(P0.01);電針組與抑制劑組之間無(wú)明顯差別(P0.05)。模型組大鼠胃內(nèi)殘留率明顯高于正常組(P0.01);與模型組比較,電針組、抑制劑組、電針+抑制劑組胃內(nèi)殘留率均明顯下降(P0.01);電針+抑制劑組胃內(nèi)殘留率低于電針組(P0.05)、抑制劑組(P0.05);電針組與抑制劑組之間胃內(nèi)殘留率無(wú)明顯差異(P0.05)。模型組大鼠小腸推進(jìn)率明顯低于正常組(P0.01);電針組、抑制劑組、電針+抑制劑組小腸推進(jìn)率均明顯高于模型組(P0.01);電針組與抑制劑組之間無(wú)明顯差異(P0.05);電針+抑制劑組小腸推進(jìn)率高于電針組(P0.05)、抑制劑組(P0.05)。各組大鼠胃竇與十二指腸組織形態(tài)學(xué)改變比較。各組大鼠胃與十二指腸組織未發(fā)現(xiàn)器質(zhì)性改變;剪開(kāi)胃體及十二指腸洗凈后,肉眼觀察僅模型組胃黏膜顏色偏白,正常組、電針組、抑制劑組、電針+抑制劑組胃組織黏膜未見(jiàn)潰瘍、出血或炎癥反應(yīng)。3.電針對(duì)FD型大鼠ENS的影響與正常組相比,模型組大鼠胃竇與十二指腸組織PGP9.5蛋白表達(dá)顯著減少(均P0.01);電針組、抑制劑組、電針+抑制劑組三組胃竇PGP9.5蛋白表達(dá)較模型組均明顯增加(P0.01,P0.05,P0.01),電針組、抑制劑組、電針+抑制劑組三組十二指腸組織中PGP9.5蛋白表達(dá)的結(jié)果也同胃竇組織,高于模型組(均P0.01);電針+抑制劑組胃竇與十二指腸組織PGP9.5蛋白水平明顯高于電針組(均P0.05)、抑制劑組(均P0.01);電針組胃竇與十二指腸組織PGP9.5蛋白水平高于抑制劑組(均P0.01)。免疫熒光染色可見(jiàn),s100β染色陽(yáng)性為紅色熒光,主要分布于胃竇與十二指腸組織粘膜層及肌層,模型組染色更強(qiáng),尤其是粘膜層熒光染色明顯增加。同時(shí)半定量分析結(jié)果顯示,模型組組胃竇與十二指腸組織s100β相對(duì)表達(dá)量顯著高于正常組;與模型組比較,電針組、抑制劑組、電針+抑制劑組大鼠胃竇與十二指腸組織中s100β相對(duì)表達(dá)量明顯降低(均P0.01);電針組與抑制劑組之間無(wú)明顯差別(均P0.05);而電針+抑制劑組胃竇與十二指腸組織s100β相對(duì)表達(dá)量低于電針組(均P0.05)、抑制劑組(均P0.05)。同時(shí)提取胃竇與十二指腸組織進(jìn)行WB分析,如圖3-3結(jié)果顯示,模型組胃竇與十二指腸組織s100β蛋白表達(dá)水平較正常組上調(diào)(均P0.01);相對(duì)于模型組,電針組、抑制劑組,電針+抑制劑組胃竇與十二指腸組織s100β蛋白表達(dá)均下降(均P0.01),電針組與抑制劑組之間無(wú)明顯差別(P0.05);而電針+抑制劑組胃竇與十二指腸組織s100β蛋白表達(dá)低于電針組(均P0.05)、抑制劑組(均P0.05)。模型組大鼠胃竇與十二指腸組織GFAP蛋白水平較正常組上升(均P0.01);電針組、抑制劑組,電針+抑制劑組大鼠胃竇(均P0.01)與十二指腸組織(P0.01,P0.05,P0.01)GFAP蛋白水平均明顯下降;且電針+抑制劑組胃竇與十二指腸組織GFAP蛋白水平低于電針組(均P0.05)、抑制劑組(均P0.05);而電針組與抑制劑組兩組之間不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P0.05)。各組大鼠胃竇與十二指腸組織PGP9.5 mRNA表達(dá)變化如下,模型組胃竇與十二指腸組織PGP9.5 mRNA水平顯著低于正常組(均P0.01);與模型組比較,電針組組、抑制劑組、電針+抑制劑組胃竇與十二指腸組織PGP9.5 mRNA表達(dá)均明顯上升(均P0.01);電針+抑制劑組胃竇與十二指腸組織PGP9.5 mRNA表達(dá)明顯高于電針組(胃竇P0.05,十二指腸P0.01)、抑制劑組(均P0.01);電針組胃竇與十二指腸組織PGP9.5mRNA水平較抑制劑組明顯上調(diào)(胃竇P0.01,十二指腸P0.05)。模型組胃竇與十二指腸組織s100βmRNA表達(dá)水平均較正常組顯著升高(P0.01);與模型組比較,電針組、抑制劑組、電針+抑制劑組胃竇與十二指腸組織s100βmRNA表達(dá)均明顯下降(均P0.01);電針組胃竇與十二指腸組織s100βmRNA表達(dá)低于抑制劑組(胃竇P0.01,十二指腸P0.05),但高于電針+抑制劑組(均P0.01);與抑制劑組相比,電針+抑制劑組胃竇與十二指腸組織s100βmRNA表達(dá)減少(均P0.01)。各組大鼠胃竇與十二指腸組織GFAP mRNA水平變化如下。模型組胃竇與十二指腸組織GFAP mRNA表達(dá)水平均顯著高于正常組(均P0.01);電針組、抑制劑組、電針+抑制劑組胃竇與十二指腸組織GFAP mRNA表達(dá)較模型組明顯下降(均P0.01);電針+抑制劑組胃竇與十二指腸組織GFAP mRNA表達(dá)明顯低于電針組(胃竇P0.05,十二指腸P0.01)、抑制劑組(均P0.01);抑制劑組胃竇與十二指腸組織GFAP mRNA表達(dá)高于電針組(胃竇P0.05,十二指腸P0.01)。4.電針對(duì)FD型大鼠GDNF及受體的影響。各組胃竇及十二指腸組織GDNF免疫組化染色結(jié)果見(jiàn)圖4-1,從圖中可以發(fā)現(xiàn),GDNF染色陽(yáng)性為棕黃色陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物。正常組大鼠胃竇黏膜層與肌層均可見(jiàn)棕黃色陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物;正常組大鼠十二指腸的棕黃色產(chǎn)物主要分布在黏膜層。模型大鼠胃竇與十二指腸組織棕黃色陽(yáng)性反應(yīng)顆粒明顯增加,尤其是黏膜層棕黃色反應(yīng)物明顯增加。通過(guò)半定量分析顯示,FD模型大鼠胃竇與十二指腸組織的GDNF相對(duì)表達(dá)量顯著高于正常組(均P0.01);與模型組相比,電針組、抑制劑組、電針+抑制劑組胃竇與十二指腸組織的GDNF相對(duì)表達(dá)量明顯降低(均P0.01)。電針+抑制劑組GDNF相對(duì)表達(dá)量低于電針組(胃竇P0.05,十二指腸P0.01)、抑制劑組(均P0.01);電針組與抑制劑組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05)。同時(shí),我們采用WB對(duì)各組大鼠胃竇與十二指腸組織的GDNF蛋白表達(dá)進(jìn)行分析,結(jié)果顯示模型組大鼠胃竇與十二指腸組織的GDNF蛋白表達(dá)增加,高于正常組(均P0.01);與模型組比較,電針組、抑制劑組、電針+抑制劑組胃竇與十二指腸組織GDNF蛋白表達(dá)顯著低于模型組(均P0.01);電針組與抑制劑組兩組比較,無(wú)明顯差異(均P0.05);電針+抑制劑組大鼠胃竇與十二指腸組織GDNF蛋白水平明顯低于電針組(均P0.05)及抑制組(均P0.05)。模型組大鼠胃竇與十二指腸組織的GFRα1蛋白水平顯著高于正常組(均P0.01);與模型組相比,電針組、抑制劑組、電針+抑制劑組胃竇與十二指腸組織的GFRα1蛋白水平顯著下降(均P0.01);電針+抑制劑組大鼠胃竇與十二指腸組織GFRα1蛋白水平明顯低于電針組(均P0.05)與抑制組(均P0.05);電針組與抑制劑組兩組比較,無(wú)明顯差異(均P0.05)。各組大鼠胃竇與十二指腸組織RET蛋白水平如下,模型組大鼠胃竇與十二指腸組織的RET蛋白水平顯著高于正常組(均P0.01);與模型組相比,電針組、抑制劑組、電針+抑制劑組胃竇與十二指腸組織的RET蛋白水平顯著下降(均P0.01);電針+抑制劑組大鼠胃竇與十二指腸組織RET蛋白水平低于電針組(均P0.05)與抑制組(均P0.01);與電針組比較,抑制劑組大鼠十二指腸組織RET蛋白水平高于電針組,而大鼠胃竇組織RET蛋白水平電針組與抑制劑組之間無(wú)明顯差異(均P0.05)。各組大鼠胃竇及十二指腸組織GDNF mRNA水平變化如下,模型組大鼠胃竇與十二指腸組織GDNF mRNA水平明顯高于正常組(P0.01);與模型組比較,電針組、抑制劑組、電針+抑制劑組胃竇與十二指腸組織GDNF mRNA水平均明顯低于模型組(均P0.01);電針+抑制劑組大鼠胃竇與十二指腸組織GDNF mRNA水平低于電針組(均P0.01)及抑制劑組(均P0.01);而電針組與抑制劑組之間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05)。5.電針對(duì)FD型大鼠MEK/ERK信號(hào)通路的影響。與正常組比較,模型組大鼠胃竇與十二指腸組織pMEK蛋白水平均顯著上調(diào)(均P0.01);與模型組比較,電針組、抑制劑組、電針+抑制劑組大鼠胃竇與十二指腸組織pMEK蛋白水平均顯著下降(均P0.01);電針+抑制劑組胃竇與十二指腸組織pMEK蛋白水平低于電針組(均P0.01)、抑制劑組(均P0.05);抑制劑組大鼠胃竇與十二指腸組織pMEK蛋白水平低于電針組(均P0.05)。與正常組比較,模型組大鼠胃竇與十二指腸組織pERK1/2蛋白水平均顯著上調(diào)(均P0.01);電針組,抑制劑組,電針+抑制劑組大鼠胃竇與十二指腸組織pERK1/2蛋白水平均顯著低于模型組(均P0.01);電針+抑制劑組胃竇與十二指腸組織pERK1/2蛋白表達(dá)低于電針組(均P0.01)、抑制劑組(均P0.05);與抑制劑組相比,電針組大鼠胃竇與十二指腸組織pERK1/2水平上升(均P0.05)。結(jié)論(1)FD模型大鼠胃竇與十二指腸組織神經(jīng)元減少,EGCs異常增殖激活,EGCs超微結(jié)構(gòu)受損。(2)電針增加FD大鼠體重,促進(jìn)胃腸動(dòng)力,同時(shí)還能改善FD大鼠一般情況。(3)電針能夠促進(jìn)受損的ENS的恢復(fù),并且ERK信號(hào)通路抑制劑與電針聯(lián)合使用,出現(xiàn)疊加效應(yīng),電針對(duì)ENS的恢復(fù)作用與ERK信號(hào)通路有關(guān)。(4)電針通過(guò)抑制FD模型大鼠MEK/ERK信號(hào)通路的激活,促進(jìn)FD大鼠受損的ENS的恢復(fù),是電針干預(yù)FD大鼠的可能作用機(jī)制之一。
【學(xué)位授予單位】：湖北中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R245.97
【圖文】：

2.2 各組大鼠胃竇與十二指腸組織 EGCs 超微結(jié)構(gòu)的變化通過(guò) TEM 觀察 EGCs 的超微結(jié)構(gòu)，顯示神經(jīng)纖維周?chē)恼?EGCs細(xì)胞結(jié)構(gòu)（圖 A,B），細(xì)胞呈不規(guī)則星形，胞核形態(tài)不規(guī)則，胞核中常染色質(zhì)較多，異染色質(zhì)較少，核周?chē)植加性S多大小不等呈圓形或橢圓形的無(wú)髓神經(jīng)纖維軸索，軸索附近含有少量的線粒體，還可見(jiàn)軸索中分布的神經(jīng)絲，胞質(zhì)中其他細(xì)胞器較少。受損的 EGCs 超微結(jié)構(gòu)可見(jiàn) EGCs 細(xì)胞核中異染色質(zhì)增多（圖 D,F,H），染色質(zhì)濃縮（圖 D,F,H），線粒體腫脹（圖E,F,G,H），內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張（圖 C,D,E,F,G,H）。圖 1-1 各組大鼠胃竇與十二指腸組織 PGP9.5、s100β、GFAP 蛋白相對(duì)表達(dá)量注：A；正常組；B：FD2 周組；C：FD3 周組；D：FD4 周組。與正常組組相比，△P<0.05，△△P<0.01；與 FD2 周組相比，%糚<0.05，%

本文編號(hào)：2775297