發(fā)布時(shí)間：2020-06-23 14:34

【摘要】：研究目的:IBS是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)疾病,并且是針灸治療的優(yōu)勢(shì)病種之一,但現(xiàn)有資料尚不能完全闡明其療效機(jī)制。近來(lái)研究表明肥大細(xì)胞活化在IBS腸道異常的免疫-神經(jīng)對(duì)話中發(fā)揮關(guān)鍵作用。肥大細(xì)胞活化后釋放脫顆粒產(chǎn)物類(lèi)胰蛋白酶(TPSP),裂解并激活腸神經(jīng)元蛋白酶激活2型受體(PAR2),促進(jìn)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)CGRP、SP釋放,而CGRP、SP可反作用于肥大細(xì)胞,加重其活化,從而誘發(fā)內(nèi)臟高敏感。其中PAR2是上述信號(hào)相互作用、形成環(huán)路的重要橋接點(diǎn)。本課題通過(guò)觀察電針對(duì)MC活化、PAR2及相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)CGRP、SP的調(diào)節(jié)作用探討電針治療IBS內(nèi)臟高敏感的機(jī)制。研究方法:以SD大鼠為研究對(duì)象,隨機(jī)分為對(duì)照組(C)、模型組(M)、模型+電針組(M+EA)、模型+PAR2-AP組(M+PAR2-AP)、模型+PAR2-AP+電針組(M+PAR2-AP+EA)。采用TNBS建立PI-IBS內(nèi)臟高敏感大鼠模型。造模完成后,AWR評(píng)分評(píng)估腸道敏感性。模型+電針組和模型+PAR2-AP+電針組(M+PAR2-AP+EA)取雙側(cè)足三里與天樞穴電針治療2周。同期模型+PAR2-AP組(M+PAR2-AP)、模型+PAR2-AP+電針組(M+PAR2-AP+EA)行PAR2激動(dòng)劑PAR2-AP灌腸操作,對(duì)照組不做特殊處理。療程結(jié)束后,各組再行一次AWR評(píng)分評(píng)估腸道敏感性變化。取結(jié)腸組織及背根神經(jīng)節(jié),采用甲苯胺藍(lán)染色法電鏡下觀察肥大細(xì)胞數(shù)目及形態(tài)改變;免疫蛋白質(zhì)印跡法、實(shí)時(shí)熒光定量PCT法和免疫熒光法檢測(cè)結(jié)腸和背根神經(jīng)節(jié)處PAR2、CGRP、SP、TPSP蛋白及mRNA表達(dá)。研究結(jié)果:1.電針可緩解PI-IBS模型大鼠內(nèi)臟高敏感,提升其疼痛閾值。腹壁撤離反射評(píng)分(AWR評(píng)分)示:與對(duì)照組相比,其他各組AWR評(píng)分均增加;與模型組相比,模型+電針組的AWR評(píng)分顯著降低;與模型+PAR2-AP組相比,模型+PAR2-AP+電針組的AWR評(píng)分顯著降低;與模型+電針組相比,模型+PAR2-AP+電針組的AWR評(píng)分有所增加。2.電針抑制肥大細(xì)胞活化及脫顆粒肥大細(xì)胞形態(tài)及脫顆粒標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果示:鏡下觀察可見(jiàn)對(duì)照組中MC形態(tài)規(guī)則,呈類(lèi)圓形,胞膜完整,未脫顆粒;與對(duì)照組比較,模型組結(jié)腸組織MC形態(tài)不規(guī)則,細(xì)胞周?chē)嗥鯛钗?呈脫顆粒狀態(tài);與模型組比較,模型+電針組MC形態(tài)規(guī)則,呈橢圓形,周?chē)儆衅鯛钗?脫顆粒程度不明顯;與模型+PAR2-AP組相比,模型+PAR2-AP+電針組形態(tài)較規(guī)則,呈橢圓形,周?chē)儆衅鯛钗?脫顆粒程度不明顯。類(lèi)胰蛋白酶(TPSP)是肥大細(xì)胞脫顆粒重要標(biāo)志物,其蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot,WB)、RT-PCR及免疫熒光(immunofluorescence,IF)檢測(cè)結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,模型組及模型+PAR2-AP組結(jié)腸組織TPSP的表達(dá)水平顯著增高。與模型組相比,模型+電針組TPSP蛋白和mRNA的表達(dá)顯著降低;與模型+PAR2-AP組相比,模型+PAR2-AP+電針組TPSP蛋白和mRNA表達(dá)顯著降低;與模型+電針組相比,模型+PAR2-AP+電針組TPSP mRNA和蛋白表達(dá)顯著升高。3.電針下調(diào)結(jié)腸PAR2、CGRP、SP表達(dá)WB、RT-PCR、IF檢測(cè)結(jié)果示:與對(duì)照組相比,模型組和模型+PAR2-AP組PAR2蛋白及mRNA表達(dá)水平顯著升高;與模型組相比,模型+電針組PAR2蛋白及mRNA表達(dá)水平顯著降低;與模型+PAR2-AP組相比,模型+PAR2-AP+電針組PAR2蛋白的表達(dá)水平降低,但高于對(duì)照組和模型+電針組。與對(duì)照組相比,模型組CGRP、SP蛋白及mRNA表達(dá)水平顯著升高,與模型組相比,模型+電針組CGRP、SP蛋白及mRNA表達(dá)顯著降低;與模型+PAR2-AP組相比,模型+PAR2-AP+電針組CGRP、SP蛋白和mRNA表達(dá)水平顯著降低。4.電針下調(diào)背根神經(jīng)節(jié)PAR2、CGRP、SP表達(dá)WB、RT-PCR、IF檢測(cè)結(jié)果示:與對(duì)照組相比,模型組和模型+PAR2-AP組PAR2、CGRP、SP蛋白及mRNA表達(dá)水平顯著增高;與模型組相比,模型+電針組上述蛋白及mRNA表達(dá)水平顯著降低;與模型+PAR2-AP組相比,模型+PAR2-AP+電針組上述蛋白及mRNA表達(dá)水平降低,但仍然高于對(duì)照組和模型+電針組。研究結(jié)論:本課題研究表明:1.TNBS灌腸所導(dǎo)致的PI-IBS病理?xiàng)l件下,大鼠內(nèi)臟痛閾值顯著降低,肥大細(xì)胞存在活化脫顆粒并興奮鄰近神經(jīng)末梢,上調(diào)其PAR2的表達(dá)并促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)CGRP和SP,誘導(dǎo)內(nèi)臟高敏感。2.電針可顯著提高PI-IBS模型大鼠內(nèi)臟痛閾,抑制結(jié)腸MC活化,下調(diào)結(jié)腸組織和背根神經(jīng)節(jié)中PAR2、TPSP、CGRP、SP蛋白及mRNA表達(dá)水平,促進(jìn)內(nèi)臟感覺(jué)傳導(dǎo)通路恢復(fù)正常。3.在外源性應(yīng)用PAR2激動(dòng)劑的條件下,電針緩解內(nèi)臟高敏感及對(duì)PAR2、TPSP、CGRP、SP等生物活性物質(zhì)的下調(diào)效應(yīng)減弱,反向證明電針通過(guò)調(diào)節(jié)PAR2的表達(dá),對(duì)MC活化-PAR2-CGRP環(huán)路形成良性調(diào)控。綜上所述:電針可通過(guò)下調(diào)PI-IBS大鼠結(jié)腸組織與背根神經(jīng)節(jié)中MC活化-PAR2-SP/CGRP信號(hào)軸水平從而減輕內(nèi)臟高敏感狀態(tài),其中PAR2是電針調(diào)節(jié)MC活化-PAR2-CGRP環(huán)路的重要靶點(diǎn)。電針足三里、天樞穴可健脾補(bǔ)虛、理氣止痛,調(diào)節(jié)免疫-神經(jīng)對(duì)話是其潛在的重要機(jī)理,本文初步闡明電針調(diào)控PAR2介導(dǎo)的免疫-神經(jīng)交互作用為其治療內(nèi)臟痛的機(jī)制之一,但因內(nèi)臟痛發(fā)生機(jī)制的復(fù)雜性,尚需深入研究以詳細(xì)闡明。
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R245.97;R-332
【圖文】：

模型＋電針組ＭＣ形態(tài)規(guī)則，呈楠圓形，周?chē)儆衅鯛钗�，脫顆粒程度不明顯；逡逑與模型＋ＰＡＲ２－ＡＰ組相比，模型＋ＰＡＲ２－ＡＰ＋電針組形態(tài)較規(guī)則，呈橢圓形，周?chē)儆衅蹂义蠣钗�，脫顆粒程度不明顯。見(jiàn)圖２。結(jié)果表明，ＰＩ－ＩＢＳ大鼠結(jié)腸粘膜中ＭＣ的活化脫顆粒逡逑程度明顯，電針可降低結(jié)腸粘膜中ＭＣ的活化脫顆粒程度。逡逑Ｉ匿，組Ｂ邋＇邐嫇Ｃ邋；逡逑．岤逡逑圖２各組大鼠結(jié)腸黏膜ＭＣ電鏡下細(xì)胞形態(tài)比較逡逑注：各組結(jié)腸粘膜ＭＣ細(xì)胞形態(tài)在電鏡卜＿觀察，放大倍數(shù)１５０００，標(biāo)尺２ｐｍ；各組箭頭所指為ＭＣ脫顆逡逑粒片絮狀物逡逑３６逡逑

逑２．２肥大細(xì)胞脫顆粒標(biāo)志物ＴＰＳＰ逡逑與對(duì)照組相比，模型組ＴＰＳＰ的表達(dá)水平顯著增高，見(jiàn)圖３Ａ。與模型組相比，模型＋逡逑電針組ＴＰＳＰ邋ｍＲＮＡ和蛋白的表達(dá)顯著降低；與模型＋ＰＡＲ２－ＡＰ組相比，模型＋ＰＡＲ２－ＡＰ＋逡逑電針組ＴＰＳＰ邋ｍＲＮＡ和蛋白表達(dá)顯著降低，但高于模型＋電針組，見(jiàn)圖３Ｂ、圖３Ｃ、圖３Ｄ。逡逑表明ＰＩ－ＩＢＳ大鼠ＴＰＳＰ邋ｍＲＮＡ和蛋白表達(dá)水平較高，電針可降低ＴＰＳＰ的表達(dá)。逡逑上述肥大細(xì)胞形體學(xué)觀察及脫顆粒標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果表明電針具有穩(wěn)定肥大細(xì)胞的作逡逑用，且這種作用可被ＰＡＲ２激動(dòng)劑部分拮抗，提示ＰＡＲ２激動(dòng)劑誘導(dǎo)的神經(jīng)興奮作用可反逡逑作用于肥大細(xì)胞。逡逑ｐ＜Ｏ．ＯＩ逡逑Ａ邐ＴＰＳＰ邐ＤＡＰＩ邐Ｍｅｒｇｅ邐Ｂ邋．邋２0邐｜邐１逡逑卜邋｜逡逑ＭＭＭ逡逑ｍ＋ａｐ邐＼ｉ＋ａｐ＋ｆ．ａ邋ｍ＋ｅａ逡逑、邐：：a蓮I邐丨？？？魯一丨－逡逑ｖ，邋１邋ｖ邋邐逡逑Ｈ邋１＾１邋Ｈ９邋ｍｍｍｍｗｍ］—逡逑Ｍｍ邐ｔ逡逑■■■ｈｉ邐＇ｒｎｌｎＩＩ逡逑~柌蜅H邋ｇ？．？ｉｉ邋＿邋ｉ邋攀邋ｉ．邋ｉ邋＿■攀逡逑圖３各組大鼠結(jié)腸組織中ＴＰＳＰ免疫熒光顯微鏡、Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ、ＲＴ－ＰＣＲ結(jié)果比較逡逑注：圖Ａ：各組大鼠結(jié)腸組織免疫熒光圖像，用抗ＴＰＳＰ（綠色）染色，標(biāo)尺ｌ0ｎｍ。圖Ｂ：邋ＲＴ－ＰＣＲ檢測(cè)逡逑ＰＡＲ２邋ｍＲＮＡ表達(dá)，內(nèi)參為ＧＡＰＤＨ。圖Ｃ：結(jié)腸組織中ＴＰＳＰ表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡。圖Ｄ：通過(guò)蚩白質(zhì)逡逑印跡測(cè)定ＰＡＲ２表達(dá)的定Ｍ

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本文編號(hào)：2727470