【摘要】：清心解瘀方是在冠心病“瘀毒”創(chuàng)新病因理論指導(dǎo)下,由陳可冀院士經(jīng)驗(yàn)方愈梗通瘀湯精簡化裁而來�！笆濉眹铱萍贾斡�(jì)劃開展的一項(xiàng)清心解瘀方對(duì)穩(wěn)定性冠心病患者臨床終點(diǎn)事件影響的多中心、大樣本、隨機(jī)、雙盲、安慰劑對(duì)照研究結(jié)果表明,在冠心病二級(jí)預(yù)防的基礎(chǔ)上加用清心解瘀方,可以降低穩(wěn)定性冠心病患者心源性死亡、非致死性心肌梗死及卒中的發(fā)生,并可減少復(fù)合終點(diǎn)事件的發(fā)生率,且安全性良好。同時(shí),前期研究發(fā)現(xiàn)清心解瘀方可以降低炎癥反應(yīng)增強(qiáng)的冠心病患者超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)等炎癥因子水平。為進(jìn)一步探討清心解瘀方發(fā)揮藥效的作用機(jī)制,本研究在課題組前期工作基礎(chǔ)上進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。研究一清心解瘀方干預(yù)穩(wěn)定性冠心病患者血清代謝組學(xué)研究目的:為深入探討清心解瘀方對(duì)機(jī)體代謝途徑及代謝物產(chǎn)生的影響,本研究在課題組前期工作基礎(chǔ)上進(jìn)行了血清代謝組學(xué)研究。方法:課題組前期進(jìn)行了多中心、隨機(jī)、雙盲、安慰劑對(duì)照試驗(yàn),在常規(guī)冠心病二級(jí)預(yù)防措施基礎(chǔ)上,試驗(yàn)組加用清心解瘀方顆粒劑治療,對(duì)照組采用安慰劑作為對(duì)照,共治療6個(gè)月,評(píng)價(jià)清心解瘀方干預(yù)穩(wěn)定性冠心病患者的臨床終點(diǎn)療效和安全性。本實(shí)驗(yàn)從其中抽取共93例患者的血樣,其中試驗(yàn)組51例,對(duì)照組42例。采用UPLC/MS SYNAPT G2-Si進(jìn)行血清代謝組學(xué)研究。將質(zhì)譜分析所得的原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入配套的Progenesis QI(Waters,Milford,USA)工作站中,將產(chǎn)生的多元數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入EZinfo數(shù)據(jù)處理軟件中進(jìn)行主成分分析(PCA)和偏最小二乘判別分析(PLS-DA),選出max fold change2,Abundance1000,P value0.05的化合物,對(duì)篩選出的化合物進(jìn)行匹配鑒定,含量分析和代謝通路分析。結(jié)果:PLS-DA分析發(fā)現(xiàn),試驗(yàn)組和對(duì)照組在治療6個(gè)月后代謝物具有明顯差異,能夠進(jìn)行較好的分離。但PCA分析可能因?yàn)榕R床樣本的個(gè)體差異而無法對(duì)差異進(jìn)行靈敏的分析�；赑LS-DA分析,經(jīng)過篩選共有17種差異代謝物。與對(duì)照組相比,試驗(yàn)組共有10種差異代謝物上調(diào),7種代謝物下調(diào)。進(jìn)一步對(duì)這些差異代謝物的代謝通路分析發(fā)現(xiàn),清心解瘀方干預(yù)后變化最大的代謝通路為甘油磷脂代謝通路。結(jié)論:清心解瘀方對(duì)穩(wěn)定性冠心病患者影響最大的代謝通路是甘油磷脂代謝通路。研究二清心解瘀方干預(yù)ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型脂質(zhì)代謝及機(jī)制研究目的:根據(jù)第一部分對(duì)清心解瘀方干預(yù)6個(gè)月后穩(wěn)定性冠心病患者血清代謝組學(xué)研究結(jié)果,清心解瘀方影響的代謝物主要來自甘油磷脂代謝通路,我們采用清心解瘀方干預(yù)高脂飲食誘導(dǎo)的ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化(AS)模型,觀察清心解瘀方對(duì)ApoE-/-小鼠AS、脂質(zhì)代謝、短鏈脂肪酸代謝及血清炎癥因子等的影響。方法:40只雄性ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為4組,每組10只。分別為清心解瘀方低劑量組(Low)、清心解瘀方高劑量組(High)、模型組(Mod)和健康對(duì)照組(Chow)。對(duì)照組給予無膽固醇低脂飼料[脂肪含量10%(wt/wt),膽固醇含量0%],其余三組給予高脂肪高膽固醇飼料喂養(yǎng),同時(shí)灌胃給予相應(yīng)藥物12周后采集小鼠代謝物、血清、回腸、回盲瓣內(nèi)容物、肝臟和主動(dòng)脈。評(píng)價(jià)各組小鼠主動(dòng)脈斑塊面積、單核/巨噬細(xì)胞浸潤情況、肝臟組織細(xì)胞形態(tài)、檢測小鼠尿液短鏈脂肪酸代謝、血清脂質(zhì)組學(xué)、血脂水平、血清白介素-1β(IL-1β)水平、脂代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平、膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)基因mRNA表達(dá)水平。結(jié)果:清心解瘀方可劑量依賴性地降低ApoE-/-小鼠AS斑塊面積和單核/巨噬細(xì)胞在斑塊部位的水平、肝臟脂肪變性,降低血清低密度脂蛋白(LDL-C)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)水平,并明顯升高高密度脂蛋白(HDL-C)水平,同時(shí)可降低血清IL-1β水平。通過對(duì)血清脂質(zhì)代謝進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn),清心解瘀方干預(yù)后影響最大的代謝通路是甘油磷脂代謝通路,與第一部分臨床樣本的結(jié)果相符。同時(shí),我們發(fā)現(xiàn)了22種差異代謝物。Low組、High組可顯著改變甘油磷脂代謝通路中關(guān)鍵酶溶血磷脂酸脂�；D(zhuǎn)移酶(AGPAT)、甘油-3-磷酸�；D(zhuǎn)移酶(GPAT)、膽堿/乙醇胺磷酸轉(zhuǎn)移酶(CEPT)和卵磷脂-膽固醇�；D(zhuǎn)移酶(LCAT)以及肝臟膽固醇代謝和膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)基因清道夫受體B1(SR-BI)、ATP結(jié)合盒蛋白A1(ABCA1)、ATP結(jié)合盒蛋白G1(ABCG1)、載脂蛋白A1(APOA-1)的mRNA表達(dá)水平,與Chow組和Mod組均具有顯著差異。清心解瘀方可顯著升高小鼠尿液丁酸、異戊酸(ISO-VA)、4-甲基戊酸(4-MEVA)水平。結(jié)論:清心解瘀方具有抗AS作用,可改善小鼠脂質(zhì)代謝、短鏈脂肪酸代謝及血清IL-11β水平。清心解瘀方對(duì)ApoE-/-小鼠甘油磷脂代謝通路影響最大,其機(jī)制可能與改變通路中關(guān)鍵酶的mRNA表達(dá)水平有關(guān)。研究三清心解瘀方重塑高脂飲食誘導(dǎo)的ApoE-/-小鼠AS模型腸道菌群目的:在證實(shí)清心解瘀方具有抗AS作用基礎(chǔ)上,通過16S rRNA測序初步研究其與腸道菌群的關(guān)系,以及抗AS作用與腸道菌群結(jié)構(gòu)變化的相關(guān)性。方法:小鼠分組同研究二,采集回盲瓣內(nèi)容物進(jìn)行16S rRNA測序。對(duì)腸道菌群樣本的群落組成和系統(tǒng)發(fā)育信息進(jìn)行alpha多樣性、beta多樣性和差異物種分析和相關(guān)性分析。結(jié)果:清心解瘀方可影響高脂飲食誘導(dǎo)的ApoE-/-小鼠AS模型腸道菌群物種豐富度但未影響物種多樣性。在所有16S rRNA測序樣本中,經(jīng)過拼接和過濾得到449個(gè)不同的操作分類單元(OTUs)。45%的OTUs(202個(gè))為各組共有,而僅有12%的OTUs(55個(gè))為各組特有。這些OTUs經(jīng)過匹配鑒定,共映射到130個(gè)菌屬,在各組間大部分菌屬(71個(gè))是共有的,僅有19個(gè)菌屬為特有菌屬。四組小鼠腸道菌群構(gòu)成絕大部分為以下5種腸道菌門:厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和撫微菌門(Verrucomicrobia)。四組小鼠腸道菌群豐度差異前 15位的菌屬為Lactobacillus、Lachnospiraceae、Faecalibaculum Lachnospiraceae、Lachnoclostridium、Bifidobacterium、Blautia、Erysipelatoclostridium、A kkermansia、Clostridium、Ruminococcus、Lachnospiraceae_NK4A136_group、Enterorhabdus、Helicobacter、g_unclassified p Firmicutes。清心解瘀方可顯著升高Akkermansia(屬疣微菌門)的比重,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。腸道菌群差異物種與血清HDL-C呈正相關(guān),同時(shí)與TC、TG、LDL-C呈負(fù)相關(guān)的菌屬只有Akkermansia菌。3個(gè)菌屬(Helicobacter,Blautia和Desulfovibrio)同IL-1β均呈現(xiàn)負(fù)相關(guān),2個(gè)菌屬(Bifidobacterium,Ruminococcus_torques_groups)呈正相關(guān)。有7個(gè)菌屬與3種短鏈脂肪酸水平呈正相關(guān)且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);有5個(gè)菌屬與3種短鏈脂肪酸呈負(fù)相關(guān)且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。小鼠腸道菌群網(wǎng)絡(luò)群落相互作用分析發(fā)現(xiàn),Lachnoclostridium屬、Erysipelatoclostridium屬、Clostridium屬和Blautia屬兩兩呈正相關(guān),提示可能存在共生關(guān)系(Community 1)。Bifidobacterium 屬、Lactobacillu 屬和Faecalibaculum屬三者兩兩呈正相關(guān),提示可能存在共生關(guān)系(Community 2)。而兩個(gè)可能存在共生關(guān)系的系統(tǒng)間兩兩呈現(xiàn)負(fù)相關(guān),提示可能存在拮抗關(guān)系。Akkermansia屬與Erysipelatoclostridium屬呈正相關(guān),而與Faecalibaculum屬和Lactobacillus屬均呈負(fù)相關(guān)。因此我們推測,清心解瘀方可能通過增加Akkermansia屬和產(chǎn)SCFAs菌(Lachnospiraceae,Blautia,Clostridium)的豐度產(chǎn)生抗AS作用。結(jié)論:清心解瘀方可重塑腸道菌群結(jié)構(gòu),并且菌群結(jié)構(gòu)變化與血清脂質(zhì)水平和抗AS作用具有相關(guān)性。
【圖文】：

圖１腸道菌群代謝物與ＣＶＤ關(guān)系示意圖逡逑注：ＭＭＩ：ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ－ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ－ｉｍｍｕｎｉｔｙ逡逑研究表明腸道菌群及其代謝物在ＡＳ及ＣＶＤ的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用（圖１邋）。逡逑腸道菌群作為一個(gè)具有活力和雙向調(diào)節(jié)的免疫及代謝調(diào)控“器官”，發(fā)揮了代謝和免疫調(diào)逡逑控作用。因此，腸道微生物途徑及腸道微生物相關(guān)的ＣＶＤ代謝物可能極大地促進(jìn)心血逡逑管健康尤其是預(yù)防ＣＶＤ。顯然，明確微生物及其代謝物與ＣＶＤ的因果關(guān)系是腸道菌群逡逑及生物標(biāo)志物研究中一個(gè)非常重要的方面。存在于人體腸道內(nèi)的腸道菌群代謝物作為逡逑“代謝過濾器”，顯著影響宿主對(duì)飲食消化吸收的方式。飲食是影響腸道微生物多樣性最逡逑重要的因素［１（）７］。內(nèi)源性代謝導(dǎo)致的慢性低度炎癥可顯著影響膽固醇代謝平衡、胰島素逡逑抵抗和血管炎癥。由于腸道微生物作在ＣＶＤ疾病中起到的作用，把其作為藥物治療的逡逑靶點(diǎn)之一對(duì)ＣＶＤ的防治具有重要意義。在相關(guān)的疾病模型中把微生物代謝物（代謝組逡逑學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等）的識(shí)別相互關(guān)聯(lián)，探究這些代謝物與宿主受體間的關(guān)系及作用機(jī)制逡逑是必要的。逡逑綜上所述，關(guān)于腸道菌群和腸道菌群代謝物的認(rèn)識(shí)深化了對(duì)ＡＳ發(fā)病的病因和病理逡逑１６逡逑

逡逑＼／＇（＾§６：４０＇＇／。精確質(zhì)量通過隨行的１＾１（８９［３７自動(dòng)校準(zhǔn)。（步驟見圖２）逡逑ＳａｍｏＪａ邋ｉｎｉｇｔ邐Ｌｏｎ邋ｍｏｂｉｌｉｔｙ邐ＭＳ邋ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ逡逑Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ邐．、－．？、逡逑ｈｉ邋ｉ｜＂邋－ｍ逡逑—ｕ邋ｖＪＬ邐Ｄｎｆｔｔｌｍｅ邐＾邋ＲＴ逡逑0．邋？邋．；邐ＣＣＳ邋ｗ邋Ｔ逡逑暑逡逑Ｄａｔａ邋ａｎａｌｙｓｉｓ逡逑Ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈｏｌｔｐｉｄｓ邋ＰＣ．邋ＳＭ，邋ＰＧ，邋ＰＥ邐ＣｈｏＥ邋ａｎｄ邋ＴＧ逡逑｜％邋？邋■ｕｉｉ．ｉ．邋？逡逑ｉ＂Ｉｐｎ．：．丨邐逡逑０邐２邐４邐６邐８邐１０邐１２邐１４邐１６邐１８邐２０逡逑Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ邋ｔｉｍｅ邋（ｍｍ）逡逑圖２代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)步驟逡逑１．４統(tǒng)計(jì)學(xué)分析逡逑臨床資料采用ＳＰＳＳ邋２０．０進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，所有計(jì)量資料均以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，逡逑計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)、百分?jǐn)?shù)表示。計(jì)量資料的比較若符合正態(tài)性分布，并滿足方差齊性檢逡逑驗(yàn)，采用ｔ檢驗(yàn)，否則采用秩和檢驗(yàn)，，汁數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)。將質(zhì)譜分析所得的原始逡逑數(shù)據(jù)導(dǎo)入配套的Ｐｒｏｇｅｎｅｓｉｓ邋Ｑ丨（Ｗａｔｅｒｓ，邋Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＵＳＡ）工作站中，對(duì)色譜峰進(jìn)行對(duì)齊，分逡逑組，峰共提取，去卷積后，將各批次所得數(shù)據(jù)用內(nèi)標(biāo)進(jìn)行校正，軟件將自動(dòng)運(yùn)行并產(chǎn)生逡逑一個(gè)包含前體離子（ｍ／ｚ），保留時(shí)間和峰面積的矩陣。將產(chǎn)生的多元數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入ＥＺｉｎｆｏ逡逑數(shù)據(jù)處理軟件屮進(jìn)行偏最小二乘判別分析（ＰＬＳ－ＤＡ）
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R259

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本文編號(hào)：2694730