發(fā)布時間：2020-05-31 18:20

【摘要】：目的:本課題旨在使GDNF、HIF-1α基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞移植電針療法應(yīng)用于脊髓損傷模型,通過對脊髓損傷大鼠行為學(xué)評價、損傷組織中β-catenin、GFAP含量的影響,評價該療法對脊髓損傷的治療作用,為GDNF、HIF-1α基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞移植電針療法在臨床中進(jìn)一步應(yīng)用提供理論依據(jù)。方法:實驗選用48只成年SD大鼠在相同條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,隨機分為4組:正常組(A組)12只,不給予特殊處理。將剩余的36只SD大鼠分成:損傷組(B組),GDNF、HIF-1α基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞組(C組),電針加GDNF、HIF-1α基因修飾的神經(jīng)干細(xì)胞組(D組)。采用脊髓損傷打擊裝置制作SD大鼠損傷模型,致B組、C組、D組的T_(12)脊髓受損。造模成功后,損傷組(B組)給予局部注射10u1 0.9%NaCl注射液;GDNF、HIF-1α修飾的神經(jīng)干細(xì)胞組(C組)給予局部注射10ul雙基因修飾的神經(jīng)干細(xì)胞液;GDNF、HIF-1α修飾的神經(jīng)干細(xì)胞加電針組(D組)給予局部注射10u1神經(jīng)干細(xì)胞液,采用雙側(cè)心俞、肺俞行電針治療;分別于移植后4個時間窗(3d、1W、2W、3W)對大鼠進(jìn)行BBB后肢評分,灌注固定后取損傷段脊髓行HE染色、免疫組化染色、Western Blot等方法,通過檢測移植處神經(jīng)干細(xì)胞β-catenin、GFAP含量水平的變化,觀察GDNF、HIF-1α基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞移植電針療法對脊髓損傷的治療效果。結(jié)果:1.神經(jīng)干細(xì)胞鑒定:細(xì)胞懸浮生長,形狀較圓,彼此黏附,并且傳代的細(xì)胞是球形分布的。病毒轉(zhuǎn)染后,24h細(xì)胞呈對稱分裂;48h細(xì)胞生長旺盛,出現(xiàn)多個細(xì)胞形成的個別細(xì)胞球;72h細(xì)胞分裂多,生長旺盛,形成更多細(xì)胞團(tuán)。2.BBB評分:1周時C組、D組的治療效果相似,2周后D組治療效果優(yōu)于C組。3.HE染色:脊髓損傷初期細(xì)胞排列稀疏,結(jié)構(gòu)紊亂,細(xì)胞內(nèi)點狀出血,形成明顯空洞。治療后,神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)局部出血減少,組織空洞相對變小,細(xì)胞排列緊密,破壞減輕,神經(jīng)纖維漸恢復(fù)。4.免疫組化染色:GFAP陽性表達(dá)為黃棕色或棕褐色,位于胞質(zhì)中且形狀不規(guī)則。GFAP在脊髓損傷后,隨著治療進(jìn)展,C組在2周后GFAP表達(dá)開始下降,D組在3天后GFAP表達(dá)即開始下降,3周后,D組GFAP表達(dá)低于C組,說明電針治療可抑制GFAP表達(dá)。5.Western Blot檢測:脊髓損傷后β-catenin的表達(dá)先上升后下降,3天內(nèi)逐漸增加,1W后逐漸降低(P0.05),且D組的β-catenin明顯高于A、B、C組,說明電針治療能促進(jìn)β-catenin表達(dá)。結(jié)論:GDNF、HIF-1α基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞移植配合電針可通過促進(jìn)β-catenin表達(dá)、抑制GFAP表達(dá)而治療脊髓損傷。
【圖文】：

⑨混勻增強液與穩(wěn)定的過氧化物酶溶液，加于 PVDF 膜上，待熒光帶明顯后，用濾紙去除多余底物液，蓋上保鮮膜，X 光片。3 統(tǒng)計學(xué)實驗數(shù)據(jù)采用 SPSS22.0 統(tǒng)計軟件分析，治療前后各組之間采用單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05，為差異有統(tǒng)計學(xué)意義：P＞0.05 為差異無統(tǒng)計學(xué)意義。4 結(jié)果4.1 神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定結(jié)果從 SD 新生大鼠大腦內(nèi)分離提取出神經(jīng)干細(xì)胞，記錄細(xì)胞形態(tài)，神經(jīng)干細(xì)胞呈現(xiàn)懸浮生長，Nestin 免疫熒光染色可以看到藍(lán)色熒光和紅色熒光，即細(xì)胞 Nestin 表達(dá)呈陽性，證明所提取的細(xì)胞為新生大鼠的神經(jīng)干細(xì)胞（圖 1-1）；病毒轉(zhuǎn)染后，，進(jìn)行熒光顯微鏡拍照，鏡下顯示綠色熒光證明成功轉(zhuǎn)染 GDNF 基因，鏡下顯示紅色熒光證明成功轉(zhuǎn)染 HIF-1α基因。轉(zhuǎn)染 24h 顯示，細(xì)胞呈對稱分裂，形成兩個大小形態(tài)基本相等的細(xì)胞（圖 1-2）；轉(zhuǎn)染 48h 熒光顯微拍照顯示，細(xì)胞生長旺盛，出現(xiàn)多個細(xì)胞形成的個別細(xì)胞球（圖 1-3）；轉(zhuǎn)染 72h 熒光顯微拍照顯示，細(xì)胞分裂多，生長旺盛，細(xì)胞球團(tuán)形成較多（圖 1-4）。

圖 1-2 轉(zhuǎn)染 24h 含 GDNF(Green)、HIF-1α(Cherry)熒光標(biāo)記的神經(jīng)干細(xì)胞（200×圖 1-3 轉(zhuǎn)染 48h 含 GDNF(Green)、HIF-1α(Cherry)熒光標(biāo)記的神經(jīng)干細(xì)胞（200×圖 1-4 轉(zhuǎn)染 72h 含 GDNF(Green)、HIF-1α(Cherry)熒光標(biāo)記的神經(jīng)干細(xì)胞（200×4.2 BBB 評分結(jié)果
【學(xué)位授予單位】：陜西中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R245.97

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2690268