發(fā)布時間：2020-05-11 13:28

【摘要】：目的干眼是臨床常見的眼表疾病,神經(jīng)調(diào)節(jié)的異常是引起干眼發(fā)病的重要原因。本研究為探討實驗兔淚液分泌反射中樞在腦的分布,以及針刺對干眼模型兔淚液分泌中樞膽堿能神經(jīng)元活動表達(dá)的影響,探討針刺調(diào)節(jié)干眼模型兔淚腺中膽堿能受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,從而促進(jìn)淚液分泌的作用機制。方法(1)健康成年新西蘭兔隨機分為3組,用已消毒干棉棒蘸取適量薄荷樟腦混合液擦拭兔雙眼下眼瞼作為模型組,并設(shè)置了生理鹽水組和完全空白組作為對照。2h后處死各組動物,應(yīng)用免疫熒光組織化學(xué)染色法結(jié)合計算機圖像分析系統(tǒng),觀察各組動物額葉、海馬、下丘腦、腦橋和延髓神經(jīng)元內(nèi)c-fos蛋白的表達(dá)情況。(2)在新西蘭兔淚腺注射微量偽狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV),采用免疫熒光組織化學(xué)方法,觀察實驗兔存活30h、38h、46h后熒光標(biāo)記神經(jīng)元在腦中的分布。(3)新西蘭兔隨機分為正常組、模型組、西藥組和針刺組4組,每組4只。正常組不做任何處理;模型組皮下注射氫溴酸東莨菪堿,2.0mg/次,4次/天,直至實驗結(jié)束;西藥組和針刺組從干眼動物模型制作成功開始,分別滴1%毛果蕓香堿滴眼液和針刺治療,連續(xù)治療7天。采用Schirmer試紙檢測各組實驗兔不同時間段淚液分泌量,采用免疫熒光組織化學(xué)方法,觀察各組實驗兔各腦區(qū)神經(jīng)元中膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(choline acetyltransferase,ChAT)表達(dá)的變化。(4)將24只新西蘭兔隨機分為4組,正常組,模型組,西藥組,針刺組,每組6只,每組處理方法同上。針刺第1,4,7,14天作眼部淚液分泌檢查。針刺后第7天,第14天分別處死各組實驗兔一半,采用Real-time PCR檢測淚腺中M3AChR、PLCβ、PKC、Ip3、PLD1、Ras、Raf、MEK、MAPK及PyK2 mRNA表達(dá)情況。結(jié)果(1)模型組可見大量的c-fos免疫陽性細(xì)胞,生理鹽水組可見少量的c-fos免疫陽性細(xì)胞,且兩組動物各腦區(qū)c-fos免疫陽性細(xì)胞表達(dá)個數(shù)均值具有顯著差異性(p0.05);完全空白組偶見極少量的c-fos免疫陽性細(xì)胞,且其與模型組相比,各腦區(qū)c-fos免疫陽性細(xì)胞表達(dá)個數(shù)均值具有顯著差異性(p0.05),其與生理鹽水組相比,額葉、海馬和腦橋c-fos免疫陽性細(xì)胞表達(dá)個數(shù)均值具有顯著性差異(p0.05),而下丘腦和延髓其個數(shù)均值無顯著性差異(p0.05)。(2)PRV注射到淚腺30h后,僅在腦橋上泌涎核出現(xiàn)陽性標(biāo)記神經(jīng)元,存活38h后,PRV跨突觸感染的第二級神經(jīng)元可見上橄欖核群的上橄欖外側(cè)核(lateral nucleus of superior olive,LSO)和上橄欖內(nèi)側(cè)核(medial nucleus of superior olive,MSO),存活46h后,在腦橋斜方體核(nucleus of trapezoid body,Tz)也出現(xiàn)陽性細(xì)胞,且上橄欖外側(cè)核和上橄欖內(nèi)側(cè)核的陽性細(xì)胞更為密集,下丘腦的室旁核(hypothalamic paraventricular,PVN)也出現(xiàn)陽性細(xì)胞。(3)Schirmer試紙檢測淚流量結(jié)果顯示,在實驗第28天即治療7天后,針刺組與西藥組與實驗第21天相比,淚流量明顯增加;實驗第28天,針刺組與西藥組分別與模型組比較,差異具有顯著性(p0.05)。ChAT免疫陽性神經(jīng)元表達(dá)與分布顯示,ChAT免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物較多位于腦橋的被蓋背側(cè)核和臂旁外側(cè)核內(nèi)。其陽性物質(zhì)計數(shù)顯示,西藥組、針刺組分別與模型組比較,被蓋背側(cè)核和臂旁外側(cè)核中ChAT免疫陽性神經(jīng)元表達(dá)個數(shù)均增多,且均值具有顯著差異性(p0.05)。(4)PCR結(jié)果示,在針刺第14天,和空白組相比,模型組淚腺中M3AChR的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著降低,差異具有顯著性(p0.05);和模型組相比,針刺組、西藥組淚腺中M3AChR的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著升高,差異具有顯著性(p0.05);和空白組相比,模型組淚腺中PLD1、MAPK、Ras的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著升高,差異具有顯著性(p0.05);和模型組相比,針刺組、西藥組淚腺中PLD1、MAPK、Ras的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著下降,差異具有顯著性(p0.05)。結(jié)論(1)針刺信息上傳至干眼模型兔淚液分泌反射中樞,再興奮其內(nèi)的膽堿能神經(jīng)元,使其支配淚腺的神經(jīng)末梢釋放ACh,促進(jìn)淚液分泌。(2)針刺能引起干眼模型兔淚腺中乙酰膽堿M受體及其介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中關(guān)鍵基因活性變化,促進(jìn)淚液分泌。
【圖文】：

蘸取液體量和擦拭強度均和生理鹽水組相同。逡逑各組實驗兔經(jīng)以上分組處理，，時間間隔２小時后１｜５７＿１５８１，進(jìn)行灌注固定，取腦組織切逡逑片（見圖１）。逡逑１６逡逑

１．邋２．邋３組織切片逡逑腦組織沉底后取出，切取視交叉后２ｍｍ和６１１１１１１［１５９］處做海馬和視丘區(qū)域冠狀切片（見逡逑圖４），切取腦橋部位，額葉部位，經(jīng)ＯＣＴ冷凍切片包埋劑包埋后，冰凍切片機－２０°Ｃ連逡逑續(xù)切片，片厚約３０ｕｍ，隔兩片取一片（見圖５），收集于ｐＨ邋＝邋７．４，邋Ｏ．Ｏｌｍｏｌ／Ｌ的ＰＢＳ中，逡逑進(jìn)行免疫熒光組織化學(xué)反應(yīng)。逡逑ｒｒｊｋ逡逑／ｆ邋＾逡逑圖４海馬和視丘區(qū)域冠狀切片邐圖５冰凍切片機切片逡逑１．２．邋４免疫熒光組織化學(xué)反應(yīng)逡逑取各組腦組織切片按照如下操作流程進(jìn)行免疫熒光組織化學(xué)反應(yīng)實驗（見圖６），詳細(xì)逡逑實驗步驟參考課題組文獻(xiàn)。逡逑１８逡逑
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R245

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本文編號：2658523