【摘要】：研究背景腸易激綜合征(irritable bowel syndrome,IBS)是臨床上最常見的功能性胃腸病(functional gastrointestinal disorders,FGIDs)之一。本病根據(jù)患者的大便性狀可分為4個亞型,分別是腹瀉型(IBS-D)、便秘型(IBS-C)、混合型(IBS-M)和不確定型(IBS-U)。本病具有發(fā)病率高、易反復(fù)發(fā)作的特點。IBS-D是IBS常見的亞型,約占所有IBS的23.4%～40%。脾腎陽虛證為IBS-D中醫(yī)的主要證型之一。國內(nèi)劉建平團(tuán)隊所做的文獻(xiàn)綜述顯示:IBS-D的主要中醫(yī)證型依次為脾胃虛弱證57.5%(23/40)脾腎陽虛證52.5%(21/40)=肝郁脾虛證52.5%(21/40)寒熱錯雜證29.6%(11/40)脾氣虛證22.5%(9/40)。脾腎陽虛證同時也是2017年腸易激綜合征中醫(yī)診療專家共識意見中IBS-D的一個主要證型。團(tuán)隊前期臨床研究發(fā)現(xiàn),采用溫腎健脾法治療IBS-D具有療效高、復(fù)發(fā)率低的臨床優(yōu)勢,總有效率為92.24%,而安慰劑對照組僅為42.5%。前期實驗研究發(fā)現(xiàn),溫腎健脾法通過改變IBS-D的肽類激素,影響結(jié)腸黏膜及回盲部肥大細(xì)胞脫顆粒,而發(fā)揮治療作用。IBS具體發(fā)病機(jī)制不清,中醫(yī)藥治療IBS具有優(yōu)勢,其取得療效的基礎(chǔ)是辨證論治。證候動物模型對中醫(yī)病因病機(jī)學(xué)和證候演變規(guī)律研究、評價中藥方劑療效和闡釋藥理機(jī)制方面,具有不可或缺的作用。目前已經(jīng)建立了肝郁脾虛證IBS-D大鼠模型,但作為臨床上十分常見的脾腎陽虛證IBS-D的大鼠模型仍沒有建立和進(jìn)行系統(tǒng)評價。基于以上背景,為了更好的評估中藥復(fù)方療效,脾腎陽虛型IBS-D病證結(jié)合大鼠模型亟需建立。研究目的:通過番瀉葉灌胃構(gòu)建中醫(yī)脾腎陽虛證,疊加IBS疾病公認(rèn)的造模方法,構(gòu)建出公認(rèn)的脾腎陽虛證IBS-D的病證結(jié)合模型,并探索模型的生物學(xué)基礎(chǔ)。為中藥單體、復(fù)方的進(jìn)一步研究提供動物模型基礎(chǔ)。研究方法1.實驗一構(gòu)建脾腎陽虛證IBS-D大鼠模型,番瀉葉灌胃劑量和周期的探索采用母子分離法建立IBS疾病模型。以高、中、低番瀉葉濃度(1.0g/ml、0.5g/ml、0.25g/ml)灌胃,分別對應(yīng)10g/kg·d、5g/kg·d和2.5g/kg·d的灌胃劑量,探索構(gòu)建脾腎陽虛證所需的劑量和周期。高、中、低劑量灌胃以探索成模的最佳劑量。分別在灌胃的2、4、6周后進(jìn)行取材,以探索成模最佳的灌胃周期。實驗大鼠共計13組,每組10只,共計130只。分為母子分離+番瀉葉高、中、低劑量組(灌胃的2、4、6周),共9組;正常組(灌胃的2、4、6周)共3組和復(fù)合組1組。復(fù)合組造模方法:每日疲勞游泳至力竭,灌服番瀉葉5g/kg·d,并腹腔注射氫化可的松10mg/kg,1次/天,連續(xù)2周。觀察大鼠皮毛變化,肛周情況,活動度和精神狀態(tài)等一般情況。綜合體重、飲食、腹瀉情況、肛溫、握力、負(fù)重游泳、腹壁撤退反射、D-木糖、尿-17羥、ACTH、CORT和病理以共同評價動物模型。2.實驗二基于核磁共振技術(shù),從代謝組學(xué)角度觀察實驗一模型構(gòu)建過程中的尿液代謝輪廓和軌跡變化,篩出差異代謝物,找出代謝通路,對模型的生物學(xué)基礎(chǔ)進(jìn)行探索3.實驗三基于16S rRNA測序,從腸道微生態(tài)角度探索實驗一模型組和正常組的菌群差異4.實驗四比較三種IBS造模方法(母子分離、直腸擴(kuò)張、避水應(yīng)激)聯(lián)合番瀉葉灌胃構(gòu)建的脾腎陽虛證IBS-D大鼠模型,優(yōu)化出最佳的動物模型根據(jù)實驗一結(jié)果,番瀉葉灌胃可以構(gòu)建出脾腎陽虛證。在番瀉葉灌胃基礎(chǔ)上,分別疊加母子分離、避水應(yīng)激、直腸擴(kuò)張三種常用的IBS疾病造模方法,通過比較,優(yōu)化出最佳的病證結(jié)合動物模型。實驗動物共計210只。分為母子分離組+番瀉葉高、中、低劑量(灌胃的2、4、6周),共9組;直腸擴(kuò)張+番瀉葉高、中、低劑量(灌胃的2、4、6周),共9組;避水應(yīng)激+番瀉葉高、中、低劑量(灌胃的2、4、6周),共9組;正常組(灌胃的2、4、6周),共3組。一共30組,每組7只。模型評價指標(biāo):大鼠的一般狀態(tài)、行為學(xué)改變、理化指標(biāo)和病理。研究結(jié)果1.脾腎陽虛證IBS-D大鼠模型番瀉葉灌胃劑量和周期的探索高、中劑量番瀉葉灌胃2～3天即可出現(xiàn)腹瀉,番瀉葉灌胃2周后,可明顯出現(xiàn)糞便粒數(shù)和Bristol分型增加,低劑量組糞便粒數(shù)無明顯增加。高、中劑量番瀉葉灌胃出現(xiàn)大鼠體重增長減緩、進(jìn)食減少、握力降低和負(fù)重游泳時間減少等變化。從灌胃劑量看,高劑量組此種變化更顯著。對于握力和負(fù)重游泳,組間出現(xiàn)明顯差異至少需要灌胃4周,提示達(dá)到陽虛需要更長時間灌胃。肛溫隨灌胃時間的延長呈現(xiàn)降低的趨勢,但在6周才出現(xiàn)明顯的差異。從血清和尿液激素水平看,高劑量番瀉葉灌胃4周可引起尿-17羥和CORT的降低,ACTH雖有降低,但未得出統(tǒng)計學(xué)差異。肛溫的顯著差異也發(fā)生在高劑量番瀉葉灌胃6周,由此可見,高劑量灌胃4周可以引起部分脾腎陽虛的改變,但高劑量番瀉葉灌胃6周更能充分表現(xiàn)出脾腎陽虛。且灌胃6周,未引起腸組織明顯的病理變化。復(fù)合因素造模雖可使大鼠出現(xiàn)腹瀉,體重降低和握力、負(fù)重游泳等自主活動能力明顯降低,但出現(xiàn)了大鼠的明顯死亡和腸道局部組織粘連現(xiàn)象。造模方法有悖于中醫(yī)的病因理論,也不符合IBS-D的功能性腸病的特點。而且操作復(fù)雜,不利于模型的重復(fù)。綜合以上分析,高劑量番瀉葉灌胃6周疊加母子分離法是構(gòu)建脾腎陽虛證IBS-D大鼠模型較為合適的造模方法。2.基于代謝組學(xué)角度探索脾腎陽虛證IBS-D大鼠模型的生物學(xué)基礎(chǔ)從大鼠尿液代謝輪廓分析可見,番瀉葉灌胃前,母子分離組和正常組的尿液代謝輪廓即顯現(xiàn)出差異,提示母子分離法具有誘導(dǎo)IBS疾病模型的作用。番瀉葉灌胃2、4、6周后,從灌胃的劑量來看,均是高劑量組的代謝改變最為明顯。進(jìn)一步進(jìn)行高劑量2、4、6周的對比,發(fā)現(xiàn)高劑量灌胃6周的代謝改變最為明顯。高劑量番瀉葉灌胃6周聯(lián)合母子分離法應(yīng)為構(gòu)建脾腎陽虛證IBS-D最佳的造模劑量和時間。在造模的過程中,上調(diào)的差異代謝物主要有:肌酸、尿囊素、馬尿酸鹽、丙酸鹽、�；撬峒�3-吲哚硫酸酯6個,下調(diào)的差異代謝物主要有:乙醇、酮戊二酸、順烏頭酸、N-乙酰天冬氨酸及甲酸鹽5個。具體涉及的代謝通路包括:�；撬岷蛠喤；撬岽x;乙醛酸和二羧酸代謝;檸檬酸循環(huán)。這些通路和機(jī)體能量代謝、應(yīng)激相關(guān)代謝、腸道菌群、膽汁酸代謝密切相關(guān)。3.基于腸道微生態(tài)角度探索脾腎陽虛證IBS-D大鼠模型的生物學(xué)基礎(chǔ)和正常組大鼠糞便菌群相比,母子分離聯(lián)合高劑量番瀉葉灌胃6周構(gòu)建的脾腎陽虛證IBS-D模型有如下特征:從菌群的相對豐度來看,可見模型組和正常組前三位的菌群均為厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門。但模型組呈現(xiàn)厚壁菌門增加,擬桿菌門減少趨勢。厚壁菌門/擬桿菌門的比值增高與稀便呈正相關(guān)。物種多樣性曲線可見,正常組和模型組的菌群多樣性差異不大,模型組物種多樣性無明顯改變,這也符合IBS-D屬于功能性疾病的特點�；贠TU的Venn圖可得,模型組和正常組共有的OTU有725個,模型組特有的OTU有25個,正常組特有的OTU有24個。也從側(cè)面反映了正常組和模型組的多樣性差異不大。差異物種分析可見,T-test:在科(family)水平上看,正常組瘤胃球菌高于模型組。在屬(genus)水平看,正常組未確定的瘤胃球菌屬、Dubosiella菌屬高于模型組。模型組顫螺菌屬、Papillibacter菌屬水平高于正常組。LefSe:正常組瘤胃球菌、未確定的瘤胃球菌高于模型組。模型組羅伊氏乳桿菌高于正常組。4.(母子分離、直腸擴(kuò)張、避水應(yīng)激)聯(lián)合番瀉葉灌胃構(gòu)建脾腎陽虛證IBS-D的比較基于內(nèi)臟高敏感、腹瀉和脾腎陽虛證(行為學(xué)和理化指標(biāo))三個方面對構(gòu)建的大鼠模型進(jìn)行評價,根據(jù)對大鼠的AWR測定,三種IBS疾病造模方法都能較好的復(fù)制大鼠的內(nèi)臟高敏感。番瀉葉灌胃的濃度可能和AWR評分呈正相關(guān)。腹瀉的程度和番瀉葉灌胃呈現(xiàn)明顯的劑量相關(guān)性,即高劑量組的大鼠腹瀉最為明顯。對于脾腎陽虛的證候指標(biāo)的評價:行為學(xué)指標(biāo)包括體重增長減緩、進(jìn)食減少、握力降低、肛溫降低和負(fù)重游泳時間減少;理化指標(biāo)包括血清D-木糖和激素水平。實驗發(fā)現(xiàn),出現(xiàn)握力降低和負(fù)重游泳時間減少,番瀉葉灌胃時間至少需要4周。高、中劑量灌胃4周可出現(xiàn)一些脾腎陽虛的行為學(xué)變化,但較6周相比,陽虛指標(biāo)隨著灌胃時間的延長呈現(xiàn)進(jìn)一步加重的趨勢。另外,從造模因素反推來看,番瀉葉灌胃只要可以持續(xù)的引起腹瀉,就會久瀉傷陽,導(dǎo)致陽虛逐漸加重。直腸擴(kuò)張和母子分離聯(lián)合高劑量番瀉葉灌胃6周均能穩(wěn)定的構(gòu)建脾腎陽虛證IBS-D大鼠模型,但兩者從數(shù)值比較,直腸擴(kuò)張組更為明顯。故6周高劑量番瀉葉灌胃疊加直腸擴(kuò)張為最佳的脾腎陽虛證IBS-D大鼠模型。研究結(jié)論1.研究一采用單味中藥番瀉葉“苦寒瀉下,日久傷陽”構(gòu)建脾腎陽虛證,造模方法相對簡單,探索了構(gòu)建脾腎陽虛證IBS-D大鼠模型需要番瀉葉灌胃的劑量和周期,即最佳劑量為高劑量組,最佳灌胃周期為6周。2.代謝組學(xué)技術(shù)可以動態(tài)觀察構(gòu)建出脾腎陽虛證IBS-D大鼠造模過程中的尿液代謝變化及其隨時間的尿液代謝變化軌跡。模型組和正常組相比,在能量代謝、應(yīng)激相關(guān)代謝、腸道菌群、膽汁酸代謝發(fā)生了代謝信息改變,有利于對動物模型進(jìn)行客觀評價�；谀c道微生態(tài),有利于發(fā)現(xiàn)差異物種,聯(lián)合應(yīng)用其他系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù),對于研究病證結(jié)合模型,深化疾病和證候的生物學(xué)基礎(chǔ)具有重要意義。3.通過對三種造模方法(母子分離、直腸擴(kuò)張、避水應(yīng)激)聯(lián)合番瀉葉灌胃構(gòu)建脾腎陽虛證IBS-D進(jìn)行比較,高劑量組番瀉葉灌胃6周聯(lián)合直腸擴(kuò)張組復(fù)制的病證結(jié)合模型最好(從實驗數(shù)值來看),其次是母子分離,避水應(yīng)激成模相對較差。
【圖文】：

觀察大鼠腹壁對腸腔球囊擴(kuò)張刺激的反應(yīng)。ＣＲＤ的壓力從ｌＯｍｍＨｇ開始，以ｌＯｍｍＨｇ逡逑壓力遞增，分別采用２０、４０、６０和８０ｍｍＨｇ四個壓力，每次擴(kuò)張持續(xù)２０ｓ，，每個壓力測逡逑２？５次，間隔４ｍｉｎ，取評分均值具體評分標(biāo)準(zhǔn)詳見圖２和表６。逡逑１邐３逡逑＼邐Ｘ邐邐＊邐邐邐逡逑２邐４逡逑圖２邋ＡＷＲ示意圖逡逑５８逡逑

壓計的束縛帶拆除，將灌胃針針尾固定在橡膠管的一側(cè)，截取長約５ｃｍ的橡膠手套套在逡逑灌胃針上作為氣囊，用手術(shù)線扎牢，最后用三通管將其連接，并確保充氣后水銀柱不下逡逑降。如圖３所示：逡逑６９逡逑
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R259;R-332

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本文編號：2626861