【摘要】：目的:本實驗采用溫針灸聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)移植治療兔膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis,KOA),探討溫針灸聯(lián)合BMSCs移植對兔KOA軟骨組織損傷的保護作用,并進一步探討其作用機制。方法:選取新西蘭大耳兔50只,雌雄各半,隨機分成5組:空白組、模型組、溫針灸組、BMSCs組、溫針灸聯(lián)合BMSCs組,每組10只。除空白組外其余4組均采用右后肢伸直位固定6周復(fù)制兔KOA中期軟骨退變模型,并用X線檢查造模是否成功,待造模成功后分別予以相應(yīng)的干預(yù)手段,7天為一個療程,共2個療程,療程結(jié)束后五組實驗兔同時取材。采用改良LequesneMG膝關(guān)節(jié)評估量表對各組兔患側(cè)膝關(guān)節(jié)行為學(xué)進行評分,彭太平法大體觀察兔KOA軟骨組織形態(tài)學(xué)變化,蘇木精-伊紅、番紅-固綠、甲苯胺藍(lán)染色法對兔KOA關(guān)節(jié)軟骨組織進行病理觀察,透射電鏡觀察軟骨細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及凋亡小體,TUNEL法觀察軟骨組織中細(xì)胞凋亡情況,免疫組化法與qPCR法觀察各組關(guān)節(jié)軟骨組織中凋亡相關(guān)因子Bax、Bcl-2、Caspase-3表達(dá)情況。所得最終實驗數(shù)值采用SPSS20.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析。結(jié)果:1.溫針灸聯(lián)合BMSCs對兔KOA軟骨組織損傷的保護作用與空白組相比,模型組兔患側(cè)膝關(guān)節(jié)腫脹,活動范圍明顯減少,LequesneMG評分顯著增加(P0.01),軟骨組織病理損傷嚴(yán)重,HE染色Mankin’s評分顯著升高(P0.01),番紅-固綠、甲苯胺藍(lán)染色見大面積失染,電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)見軟骨細(xì)胞發(fā)生退變,細(xì)胞外血管坍塌,局部可見多個凋亡小體。與模型組相比,經(jīng)溫針灸、BMSCs、溫針灸聯(lián)合BMSCs治療后,關(guān)節(jié)功能有所恢復(fù),癥狀減輕,LequesneMG評分明顯降低(P0.01),軟骨組織病理損傷程度改善(P0.01),透射電鏡見軟骨細(xì)胞損傷有所恢復(fù),外周血管略水腫,但血運逐漸恢復(fù),可見少量紅細(xì)胞。且溫針灸聯(lián)合BMSCs對上述指標(biāo)的改善作用均優(yōu)于單純溫針灸與單純BMSCs移植治療(P0.05)。2.溫針灸聯(lián)合BMSCs對兔KOA軟骨組織損傷的保護作用機制與空白組相比,模型組TUNEL陽性軟骨細(xì)胞數(shù)量顯著增多(P0.01),且全層可見,軟骨細(xì)胞中Bax、Caspase-3蛋白及mRNA表達(dá)顯著升高(P0.01),Bcl-2蛋白及mRNA表達(dá)降低(P0.01);與模型組相比,經(jīng)溫針灸聯(lián)合BMSCs治療后可以顯著減少軟骨細(xì)胞凋亡的數(shù)量(P0.01),軟骨組織中凋亡相關(guān)因子表達(dá)明顯改善,其中Bcl-2蛋白及mRNA表達(dá)顯著升高,Bax、Caspase-3蛋白及mRNA表達(dá)顯著降低(P0.01)。結(jié)論:1.溫針灸聯(lián)合BMSCs移植能夠有效抑制兔KOA軟骨組織損傷,且作用效果明顯優(yōu)于單純溫針灸與單純BMSCs,肯定協(xié)同增效作用。2.溫針灸聯(lián)合BMSCs移植治療兔KOA的機理可能是通過降低Bax、Caspase-3表達(dá),上調(diào)Bcl-2水平,抑制軟骨細(xì)胞凋亡,從而發(fā)揮治療KOA的作用。
【圖文】：

BMSCs換液

擰開瓶蓋，瓶口過火，用巴氏吸管將瓶內(nèi)的完全培養(yǎng)基吸出，棄至廢液缸中，取新的巴氏吸管向瓶內(nèi)加入 3mLPBS，洗去殘留的舊培養(yǎng)基，然后向瓶中加入 1mL 經(jīng) 37℃預(yù)熱的胰酶，顯微鏡下觀察當(dāng)細(xì)胞回縮為圓形時，敲擊瓶壁，促使貼壁細(xì)胞脫落，然后向其中加入 3mL 完全培養(yǎng)基終止消化，吹打細(xì)胞使其完全脫壁后，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15mL 離心管中，1000r/min×3min 離心，取出置于超凈臺中，棄上清，向離心管中加入3mL 完全培養(yǎng)基吹打重懸，將懸液分為三份轉(zhuǎn)移至 3 個已盛有 4mL 完全培養(yǎng)基的 T25培養(yǎng)瓶中，瓶口過火后擰緊瓶蓋，十字法搖勻，將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。2.3.4 BMSCs 懸液的配制:將 0.9% NaCl 溶液、胰酶、完全培養(yǎng)基預(yù)熱至 37℃，取體外培養(yǎng)的第 3 代 BMSCs 經(jīng)胰酶消化，倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞回縮為圓形時，敲擊培養(yǎng)瓶壁，使細(xì)胞脫落，加入含血清的完全培養(yǎng)基終止消化，收集細(xì)胞懸液置于 15mL 離心管中，，1000r/min×3min 離心，棄上清，加入生理鹽水吹打重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，分裝于 1mL 注射器中備用。
【學(xué)位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R245

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