發(fā)布時間：2020-03-24 10:22

【摘要】：目的流行病學調(diào)查顯示,目前中國腦卒中死亡的人數(shù)已超過腫瘤和心血管病,位于致死原因的首位。本研究借助大腦中動脈閉塞(MCAO)大鼠模型,按照“標本配穴”法原則,以“百會”為“標穴”,醒神開竅,以“腎俞”、“三陰交”為“本穴”,補益肝腎、通經(jīng)活絡,觀察電針預處理對MCAO模型大鼠的海馬組織中炎癥、氧化、凋亡的影響,并以絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路為主線探索調(diào)節(jié)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的平衡機制,為臨床“標本配穴”法的應用,以及電針預處理干預腦缺血再灌注損傷(CIRI)相關性疾病提供重要的理論基礎和指導方向。方法SPF級雄性SD大鼠128只,適應性喂養(yǎng)一周,隨機分為正常組(Control group),假手術組(Sham group)、大鼠腦中動脈缺血組(MCAO group)和電針預處理組(EA+MCAO group);大鼠大腦中動脈缺血組采用線拴法復制MCAO模型;電針預處理組先進行電針預處理一小時,大鼠休息0.5h后再制作MCAO模型;假手術組除不插硅膠線阻塞血管外,其余操作與大鼠腦中動脈缺血組相同;正常組不給予任何處理。1、大鼠神經(jīng)功能損傷評分:分別對造模后3h,6h,12h,24h四個時間點的大鼠進行神經(jīng)功能缺損評分;2、形態(tài)學觀察:MCAO模型大鼠于造模后6h取材,Triphenyltetra zolium chloride(TTC)染色檢測腦梗死的體積,HE染色觀察海馬神經(jīng)元的顯微結構,透射電鏡觀察海馬組織神經(jīng)元的超微結構;3、炎癥因子的檢測:MCAO模型大鼠于造模后6h取材,免疫組化檢測海馬組織腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的表達,Elisa檢測海馬組織TNF-α、白細胞介素-1β(IL-1β)的含量;4、氧化應激指標的檢測:MCAO模型大鼠造模后6h取材,透射電鏡觀察海馬神經(jīng)元線粒體超微結構,免疫組化法檢測海馬組織細胞色素C(Cyt-c)表達,Elisa法檢測海馬組織腦組織超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)的表達;5、凋亡通路因子的檢測:免疫組化檢測海馬組織裂解的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)、Bcl-2相關X蛋白(Bax)、B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)的表達,WB檢測海馬組織Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2的表達;6、MAPK家族蛋白表達的檢測:WB檢測海馬組織中MAPK通路相關蛋白的表達,計算三條并行通路ERK,JNK,P38MAPK的非磷酸化和磷酸化比值。結果1、電針預處理對再灌注6h的MCAO模型大鼠的干預效果最為顯著再灌注3h,6h,12h,24h后,對各組大鼠神經(jīng)功能損傷進行評分,結果顯示,與同一時間點的大鼠中動脈缺血組相比,電針預處理在缺血再灌注6h,對大腦損傷的干預效果最顯著,因此在后續(xù)實驗研究中將再灌注6h作為電針預處理機制研究的觀測點。2、電針預處理減輕MCAO模型大鼠海馬神經(jīng)元的形態(tài)學異常⑴電針預處理減少腦梗塞的體積。TTC染色深紅色區(qū)域為正常組織,而TTC染色白色區(qū)域為梗死區(qū)域。染色結果顯示正常組和假手術組未出現(xiàn)明顯白色區(qū)域;MCAO組大鼠腦組織出現(xiàn)大面積白色梗死灶;與大鼠腦中動脈缺血組相比,電針預處理組梗死體積明顯減少,白色區(qū)域明顯較小(P0.05)。⑵電針預處理可以減輕MCAO模型大鼠的海馬神經(jīng)元損傷。HE染色顯示正常組和假手術組大鼠的海馬神經(jīng)元形態(tài)上未出現(xiàn)明顯異常;大鼠腦中動脈缺血組大鼠海馬神經(jīng)元細胞排列紊亂,胞體內(nèi)可見大量空泡,細胞核溶解甚至消失,大量細胞退行性壞死;電針預處理組大鼠海馬組織神經(jīng)元細胞排列欠整齊,細胞質(zhì)中可見少量空泡,核膜皺縮。⑶電針預處理可以減輕大鼠海馬神經(jīng)元細胞器的損傷。透射電鏡顯示正常組和假手術組大鼠海馬組織神經(jīng)元細胞膜完整,平滑,細胞器結構正常;中動脈阻塞組大鼠海馬神經(jīng)元細胞可見細胞膜中斷,細胞核核膜破裂,核染色質(zhì)逐漸向中央集聚成輪廓不規(guī)則的團塊,線粒體出現(xiàn)大量腫脹甚至溶解;電針預處理組大鼠海馬神經(jīng)元細胞膜欠完整,核染色質(zhì)部分聚集,線粒體稍腫脹,可見部分線粒體嵴。3、炎癥相關指標的檢測⑴Elisa檢測TNF-α、IL-1β的表達正常組和假手術組海馬組織TNF-α、IL-1β的含量進行比較,結果提示差異沒有統(tǒng)計意義(P0.05);大鼠腦中動脈缺血組與假手術組比較,顯示TNF-α、IL-1β含量增加,差異有統(tǒng)計意義(P0.05);電針預處理組與大鼠腦中動脈缺血組比較,電針預處理可見TNF-α、IL-1β表達明顯減少,差異有統(tǒng)計意義(P0.05)。⑵免疫組化檢測TNF-α的表達正常組和假手術組海馬組織TNF-α的表達,差異沒有統(tǒng)計意義(P0.05);與正常組和假手術組比較,結果提示大鼠腦中動脈缺血組合電針預處理組TNF-α表達明顯增加,差異有統(tǒng)計意義(P0.05);電針預處理組與大鼠腦中動脈缺血組比較,可見TNF-α的陽性細胞表達明顯減少,差異有統(tǒng)計意義(P0.05)。4、氧化應激相關指標的檢測⑴電針預處理減輕模型大鼠海馬神經(jīng)元線粒體腫脹和空泡率線粒體是細胞進行電子氧化、產(chǎn)生能量的結構單位,正常組和假手術組的線粒體結構未見明顯異常;大鼠腦中動脈缺血組出現(xiàn)線粒體損傷化的特征性征象,如缺乏典型的管狀或橢圓形形態(tài),雙膜結構消失,空泡化,線粒體嵴中斷甚至消失;電針預處理組也可見線粒體明顯改變,線粒體嵴腫脹、形態(tài)呈圓形。⑵電針預處理減少模型大鼠海馬組織Cyt-c表達Cyt-c為生物氧化過程中的電子傳遞體,電子傳遞增加,會消耗大量氧原子,產(chǎn)生大量氧自由基;正常組和假手術組Cyt-c的陽性細胞表達數(shù)沒有統(tǒng)計學意義(P0.05);電針預處理組和大鼠腦中動脈缺血組顯示Cyt-c陽性細胞數(shù)表達較假手術組明顯增加。電針預處理組與大鼠腦中動脈缺血組比較,Cyt-c表達有所減少,組間差異有統(tǒng)計意義(P0.05)。⑶電針預處理調(diào)節(jié)模型大鼠海馬組織MDA、SOD、GSH的表達氧化應激產(chǎn)物MDA在正常組和假手術組比較,差異沒有統(tǒng)計意義(P0.05);電針預處理組和大鼠腦中動脈缺血組的MDA含量與假手術組的MDA含量比較,差異有統(tǒng)計意義(P0.05);電針預處理組可見MDA的含量較大鼠腦中動脈缺血組明顯減少,差異有統(tǒng)計意義(P0.05)�？寡趸蜃覵OD、GSH在正常組和假手術組比較,差異沒有統(tǒng)計意義(P0.05);大鼠腦中動脈缺血組與正常組和假手術組比較,顯示SOD、GSH減少,差異有統(tǒng)計意義(P0.05);電針預處理組可見SOD、GSH較大鼠腦中動脈缺血組明顯增加,差異有統(tǒng)計意義(P0.05);5、凋亡相關指標檢測的表達⑴免疫組化和WB檢測Bax、Bcl-2的表達Bcl-2/Bax在正常組和假手術組間進行比較,差異沒有統(tǒng)計學意義(P0.05);大鼠腦中動脈缺血組與假手術組比較,Bax增加,Bcl-2減少,Bcl-2/Bax下調(diào),差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);與大鼠腦中動脈缺血組比較,電針預處理組Bax減少,Bcl-2增加,Bcl-2/Bax較大鼠腦中動脈缺血組上調(diào),差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。⑵免疫組化和WB檢測Cleaved Caspase-3的表達Cleaved Caspase-3在正常組和假手術組內(nèi)的表達,差異沒有統(tǒng)計學意義(P0.05);與正常組和假手術組比較,大鼠腦中動脈缺血組Cleaved Caspase-3增加,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);與大鼠腦中動脈缺血組比較電針預處理組Cleaved Caspase-3減少,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。6、MAPK家族蛋白的表達⑴與假手術組比較,大鼠腦中動脈缺血組和電針預處理組pERK/ERK上調(diào),差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);但是大鼠腦中動脈缺血組和電針預處理組兩組間沒有差距,差異沒有統(tǒng)計學意義(P0.05)。⑵p-JNK/JNK在四組間的表達沒有明顯差距,差異沒有統(tǒng)計學意義(P0.05)。⑶p-P38MAPK/P38MAPK在大鼠腦中動脈缺血組和電針預處理組較正常組和假手術組都明顯上調(diào),差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);而電針預處理組明顯低于大鼠腦中動脈缺血組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論1、電針預處理可以減少MCAO模型大鼠的腦梗死體積,減輕神經(jīng)元的病變程度。2、電針預處理能抑制促炎因子TNF-α、IL-1β的表達,控制炎性反應,減輕腦缺血再灌注的損傷。3、電針預處理可減輕線粒體的損傷,抑制Cyt-c的表達,通過調(diào)節(jié)氧化和抗氧化因子的失衡,發(fā)揮神經(jīng)保護的作用。4、電針預處理可以調(diào)節(jié)海馬組織Bcl-2/Bax的失衡,減少Cleaved Caspase-3的表達,進而抑制神經(jīng)細胞凋亡,減輕腦缺血再灌注的損傷。5、電針預處理通過調(diào)節(jié)MAPK家族蛋白中p-P38MAPK與P38MAPK的比例,調(diào)節(jié)腦內(nèi)病理過程的平衡,起到保護腦神經(jīng)元的作用。
【圖文】：

圖 1-1 大鼠 MCAO 模型制作除不插硅膠線阻塞血管外，其它操作與大鼠腦理方式ml/100g 腹腔注射 5%戊巴比妥鈉溶液進行麻醉處理針刺方法：參照中國針灸學會實驗針灸研究會穴位圖譜》標準[15]取穴（圖 1-2），，取大鼠“百會23)、“三陰交穴”(SP6)。“百會穴”(GV20)：頂骨前或后平刺 2mm；“雙側腎俞穴”(BL23)：第二

百會(GV20)、腎俞(BL23)、三陰交(SP6)
【學位授予單位】：湖北中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R245.97;R-332

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5 高楊;孫思斯;劉f逃

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