【摘要】：目的流行病學(xué)調(diào)查顯示,目前中國腦卒中死亡的人數(shù)已超過腫瘤和心血管病,位于致死原因的首位。本研究借助大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)大鼠模型,按照“標(biāo)本配穴”法原則,以“百會”為“標(biāo)穴”,醒神開竅,以“腎俞”、“三陰交”為“本穴”,補(bǔ)益肝腎、通經(jīng)活絡(luò),觀察電針預(yù)處理對MCAO模型大鼠的海馬組織中炎癥、氧化、凋亡的影響,并以絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路為主線探索調(diào)節(jié)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的平衡機(jī)制,為臨床“標(biāo)本配穴”法的應(yīng)用,以及電針預(yù)處理干預(yù)腦缺血再灌注損傷(CIRI)相關(guān)性疾病提供重要的理論基礎(chǔ)和指導(dǎo)方向。方法SPF級雄性SD大鼠128只,適應(yīng)性喂養(yǎng)一周,隨機(jī)分為正常組(Control group),假手術(shù)組(Sham group)、大鼠腦中動(dòng)脈缺血組(MCAO group)和電針預(yù)處理組(EA+MCAO group);大鼠大腦中動(dòng)脈缺血組采用線拴法復(fù)制MCAO模型;電針預(yù)處理組先進(jìn)行電針預(yù)處理一小時(shí),大鼠休息0.5h后再制作MCAO模型;假手術(shù)組除不插硅膠線阻塞血管外,其余操作與大鼠腦中動(dòng)脈缺血組相同;正常組不給予任何處理。1、大鼠神經(jīng)功能損傷評分:分別對造模后3h,6h,12h,24h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)的大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分;2、形態(tài)學(xué)觀察:MCAO模型大鼠于造模后6h取材,Triphenyltetra zolium chloride(TTC)染色檢測腦梗死的體積,HE染色觀察海馬神經(jīng)元的顯微結(jié)構(gòu),透射電鏡觀察海馬組織神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu);3、炎癥因子的檢測:MCAO模型大鼠于造模后6h取材,免疫組化檢測海馬組織腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的表達(dá),Elisa檢測海馬組織TNF-α、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)的含量;4、氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測:MCAO模型大鼠造模后6h取材,透射電鏡觀察海馬神經(jīng)元線粒體超微結(jié)構(gòu),免疫組化法檢測海馬組織細(xì)胞色素C(Cyt-c)表達(dá),Elisa法檢測海馬組織腦組織超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)的表達(dá);5、凋亡通路因子的檢測:免疫組化檢測海馬組織裂解的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)的表達(dá),WB檢測海馬組織Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2的表達(dá);6、MAPK家族蛋白表達(dá)的檢測:WB檢測海馬組織中MAPK通路相關(guān)蛋白的表達(dá),計(jì)算三條并行通路ERK,JNK,P38MAPK的非磷酸化和磷酸化比值。結(jié)果1、電針預(yù)處理對再灌注6h的MCAO模型大鼠的干預(yù)效果最為顯著再灌注3h,6h,12h,24h后,對各組大鼠神經(jīng)功能損傷進(jìn)行評分,結(jié)果顯示,與同一時(shí)間點(diǎn)的大鼠中動(dòng)脈缺血組相比,電針預(yù)處理在缺血再灌注6h,對大腦損傷的干預(yù)效果最顯著,因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究中將再灌注6h作為電針預(yù)處理機(jī)制研究的觀測點(diǎn)。2、電針預(yù)處理減輕MCAO模型大鼠海馬神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)異常⑴電針預(yù)處理減少腦梗塞的體積。TTC染色深紅色區(qū)域?yàn)檎＝M織,而TTC染色白色區(qū)域?yàn)楣Ｋ绤^(qū)域。染色結(jié)果顯示正常組和假手術(shù)組未出現(xiàn)明顯白色區(qū)域;MCAO組大鼠腦組織出現(xiàn)大面積白色梗死灶;與大鼠腦中動(dòng)脈缺血組相比,電針預(yù)處理組梗死體積明顯減少,白色區(qū)域明顯較小(P0.05)。⑵電針預(yù)處理可以減輕MCAO模型大鼠的海馬神經(jīng)元損傷。HE染色顯示正常組和假手術(shù)組大鼠的海馬神經(jīng)元形態(tài)上未出現(xiàn)明顯異常;大鼠腦中動(dòng)脈缺血組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞排列紊亂,胞體內(nèi)可見大量空泡,細(xì)胞核溶解甚至消失,大量細(xì)胞退行性壞死;電針預(yù)處理組大鼠海馬組織神經(jīng)元細(xì)胞排列欠整齊,細(xì)胞質(zhì)中可見少量空泡,核膜皺縮。⑶電針預(yù)處理可以減輕大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞器的損傷。透射電鏡顯示正常組和假手術(shù)組大鼠海馬組織神經(jīng)元細(xì)胞膜完整,平滑,細(xì)胞器結(jié)構(gòu)正常;中動(dòng)脈阻塞組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞可見細(xì)胞膜中斷,細(xì)胞核核膜破裂,核染色質(zhì)逐漸向中央集聚成輪廓不規(guī)則的團(tuán)塊,線粒體出現(xiàn)大量腫脹甚至溶解;電針預(yù)處理組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞膜欠完整,核染色質(zhì)部分聚集,線粒體稍腫脹,可見部分線粒體嵴。3、炎癥相關(guān)指標(biāo)的檢測⑴Elisa檢測TNF-α、IL-1β的表達(dá)正常組和假手術(shù)組海馬組織TNF-α、IL-1β的含量進(jìn)行比較,結(jié)果提示差異沒有統(tǒng)計(jì)意義(P0.05);大鼠腦中動(dòng)脈缺血組與假手術(shù)組比較,顯示TNF-α、IL-1β含量增加,差異有統(tǒng)計(jì)意義(P0.05);電針預(yù)處理組與大鼠腦中動(dòng)脈缺血組比較,電針預(yù)處理可見TNF-α、IL-1β表達(dá)明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)意義(P0.05)。⑵免疫組化檢測TNF-α的表達(dá)正常組和假手術(shù)組海馬組織TNF-α的表達(dá),差異沒有統(tǒng)計(jì)意義(P0.05);與正常組和假手術(shù)組比較,結(jié)果提示大鼠腦中動(dòng)脈缺血組合電針預(yù)處理組TNF-α表達(dá)明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)意義(P0.05);電針預(yù)處理組與大鼠腦中動(dòng)脈缺血組比較,可見TNF-α的陽性細(xì)胞表達(dá)明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)意義(P0.05)。4、氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的檢測⑴電針預(yù)處理減輕模型大鼠海馬神經(jīng)元線粒體腫脹和空泡率線粒體是細(xì)胞進(jìn)行電子氧化、產(chǎn)生能量的結(jié)構(gòu)單位,正常組和假手術(shù)組的線粒體結(jié)構(gòu)未見明顯異常;大鼠腦中動(dòng)脈缺血組出現(xiàn)線粒體損傷化的特征性征象,如缺乏典型的管狀或橢圓形形態(tài),雙膜結(jié)構(gòu)消失,空泡化,線粒體嵴中斷甚至消失;電針預(yù)處理組也可見線粒體明顯改變,線粒體嵴腫脹、形態(tài)呈圓形。⑵電針預(yù)處理減少模型大鼠海馬組織Cyt-c表達(dá)Cyt-c為生物氧化過程中的電子傳遞體,電子傳遞增加,會消耗大量氧原子,產(chǎn)生大量氧自由基;正常組和假手術(shù)組Cyt-c的陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);電針預(yù)處理組和大鼠腦中動(dòng)脈缺血組顯示Cyt-c陽性細(xì)胞數(shù)表達(dá)較假手術(shù)組明顯增加。電針預(yù)處理組與大鼠腦中動(dòng)脈缺血組比較,Cyt-c表達(dá)有所減少,組間差異有統(tǒng)計(jì)意義(P0.05)。⑶電針預(yù)處理調(diào)節(jié)模型大鼠海馬組織MDA、SOD、GSH的表達(dá)氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA在正常組和假手術(shù)組比較,差異沒有統(tǒng)計(jì)意義(P0.05);電針預(yù)處理組和大鼠腦中動(dòng)脈缺血組的MDA含量與假手術(shù)組的MDA含量比較,差異有統(tǒng)計(jì)意義(P0.05);電針預(yù)處理組可見MDA的含量較大鼠腦中動(dòng)脈缺血組明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)意義(P0.05)�？寡趸蜃覵OD、GSH在正常組和假手術(shù)組比較,差異沒有統(tǒng)計(jì)意義(P0.05);大鼠腦中動(dòng)脈缺血組與正常組和假手術(shù)組比較,顯示SOD、GSH減少,差異有統(tǒng)計(jì)意義(P0.05);電針預(yù)處理組可見SOD、GSH較大鼠腦中動(dòng)脈缺血組明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)意義(P0.05);5、凋亡相關(guān)指標(biāo)檢測的表達(dá)⑴免疫組化和WB檢測Bax、Bcl-2的表達(dá)Bcl-2/Bax在正常組和假手術(shù)組間進(jìn)行比較,差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);大鼠腦中動(dòng)脈缺血組與假手術(shù)組比較,Bax增加,Bcl-2減少,Bcl-2/Bax下調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與大鼠腦中動(dòng)脈缺血組比較,電針預(yù)處理組Bax減少,Bcl-2增加,Bcl-2/Bax較大鼠腦中動(dòng)脈缺血組上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。⑵免疫組化和WB檢測Cleaved Caspase-3的表達(dá)Cleaved Caspase-3在正常組和假手術(shù)組內(nèi)的表達(dá),差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與正常組和假手術(shù)組比較,大鼠腦中動(dòng)脈缺血組Cleaved Caspase-3增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與大鼠腦中動(dòng)脈缺血組比較電針預(yù)處理組Cleaved Caspase-3減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。6、MAPK家族蛋白的表達(dá)⑴與假手術(shù)組比較,大鼠腦中動(dòng)脈缺血組和電針預(yù)處理組pERK/ERK上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);但是大鼠腦中動(dòng)脈缺血組和電針預(yù)處理組兩組間沒有差距,差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。⑵p-JNK/JNK在四組間的表達(dá)沒有明顯差距,差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。⑶p-P38MAPK/P38MAPK在大鼠腦中動(dòng)脈缺血組和電針預(yù)處理組較正常組和假手術(shù)組都明顯上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);而電針預(yù)處理組明顯低于大鼠腦中動(dòng)脈缺血組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論1、電針預(yù)處理可以減少M(fèi)CAO模型大鼠的腦梗死體積,減輕神經(jīng)元的病變程度。2、電針預(yù)處理能抑制促炎因子TNF-α、IL-1β的表達(dá),控制炎性反應(yīng),減輕腦缺血再灌注的損傷。3、電針預(yù)處理可減輕線粒體的損傷,抑制Cyt-c的表達(dá),通過調(diào)節(jié)氧化和抗氧化因子的失衡,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的作用。4、電針預(yù)處理可以調(diào)節(jié)海馬組織Bcl-2/Bax的失衡,減少Cleaved Caspase-3的表達(dá),進(jìn)而抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡,減輕腦缺血再灌注的損傷。5、電針預(yù)處理通過調(diào)節(jié)MAPK家族蛋白中p-P38MAPK與P38MAPK的比例,調(diào)節(jié)腦內(nèi)病理過程的平衡,起到保護(hù)腦神經(jīng)元的作用。
【圖文】：

圖 1-1 大鼠 MCAO 模型制作除不插硅膠線阻塞血管外，其它操作與大鼠腦理方式ml/100g 腹腔注射 5%戊巴比妥鈉溶液進(jìn)行麻醉處理針刺方法：參照中國針灸學(xué)會實(shí)驗(yàn)針灸研究會穴位圖譜》標(biāo)準(zhǔn)[15]取穴（圖 1-2），，取大鼠“百會23)、“三陰交穴”(SP6)�！鞍贂ā�(GV20)：頂骨前或后平刺 2mm；“雙側(cè)腎俞穴”(BL23)：第二

百會(GV20)、腎俞(BL23)、三陰交(SP6)
【學(xué)位授予單位】：湖北中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R245.97;R-332

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本文編號：2598186