本文選題：重癥肌無力(MG) + 慢性淺表性胃炎(CSG)�。� 參考：《廣州中醫(yī)藥大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：研究背景：祖國醫(yī)學(xué)認為“脾主涎”、“脾在液為涎”,涎即唾液。唾液中最重要的蛋白是唾液淀粉酶(sAA),占唾液蛋白的40-一50%,很多學(xué)者利用sAA活性對脾虛證本質(zhì)進行了研究。廣州中醫(yī)藥大學(xué)脾胃研究所王建華教授帶領(lǐng)的團隊于上世紀70年代首次發(fā)現(xiàn)脾虛證患者在檸檬酸酸刺激后sAA活性下降,此后該研究得到國內(nèi)多個單位的重復(fù),且在不同疾病的脾氣虛證患者中得到驗證,1993年衛(wèi)生部將該指標列入《中藥新藥臨床指導(dǎo)原則》作為脾氣虛證療效的評價指標。sAA活性變化是脾虛證候研究中的典型范例,然而在對脾虛證患者sAA活性進一步研究中也發(fā)現(xiàn)了一些不足之處,如在多種疾病脾虛證中檢出率約為60%,特異性不高,指標背后的的深層次信息如調(diào)控因素、干擾因素等缺乏深入研究,影響了該指標反映脾虛證候本質(zhì)的特異性。既往研究發(fā)現(xiàn)sAA主要以非糖基化和N-糖基化形式存在,糖基化的sAA根據(jù)其生物活性強弱從高至低分為復(fù)合型、雜合型、高甘露糖型3種亞型。sAA活性改變這一生化指標改變現(xiàn)象的背后,可能與sAA糖基化與非糖基化的存在情況、sAA糖基化3種亞型的比例改變等分子背景有重要關(guān)聯(lián)。因此有必要從N糖基化及其亞型結(jié)構(gòu)角度深入探討脾氣虛證患者sAA活性改變的分子機制及影響因素。研究目的：初步探討脾氣虛證臨床癥候與sAA活性比值之間的關(guān)聯(lián)性;通過對兩種不同系統(tǒng)疾病(慢性淺表性胃炎與重癥肌無力),脾氣虛證(虛證)、脾虛濕熱證(虛實夾雜)及肝胃不和證(實證)患者sAA活性、N-糖基化蛋白表達及N-糖鏈亞型構(gòu)成比的觀察,以健康志愿者為對照,在分子水平探討脾氣虛證患者sAA活性改變的機制,為祖國醫(yī)學(xué)“脾主涎”理論的科學(xué)內(nèi)涵提供依據(jù)。研究內(nèi)容本課題選取了兩種疾病三種中醫(yī)證型：消化系統(tǒng)疾病——慢性淺表性胃炎(CSG)脾氣虛證、脾虛濕熱證與肝胃不和證；非消化系統(tǒng)疾病——重癥肌無力(MG)脾氣虛證及脾虛濕熱證,分別觀察sAA活性、sAAN-糖基化蛋白表達及sAAN-糖鏈亞型構(gòu)成比的變化情況,并對比分析脾氣虛證(虛證)、脾虛濕熱證(虛實夾雜)及肝胃不和證(實證)患者sAA各指標間的差異,從異病同證角度驗證脾氣虛證患者sAA的變化規(guī)律,并從N-糖基化角度探討脾氣虛證患者sAA活性改變的機制。材料與方法：1.研究對象符合診斷標準的MG患者61例,其中脾氣虛證患者33例,脾虛濕熱證患者23例,脾腎虧虛5例(因例數(shù)較少,暫未分析其指標)；慢性淺表性胃炎患者101例,其中脾氣虛證患者36例,脾虛濕熱證患者40例,肝胃不和證25例,同時選取健康志愿者36例。2.研究方法2.1受試患者情況分析建立MG及CSG各證型患者的臨床癥候表現(xiàn)數(shù)據(jù)庫,進行頻次及逐步回歸分析,觀察不同中醫(yī)證型的癥候表現(xiàn),作為癥候與sAA活性關(guān)聯(lián)性研究的基礎(chǔ)。2.2唾液樣本采集使用專用唾液采集管,以口內(nèi)轉(zhuǎn)動棉柱法采集唾液樣本。按住院部患者(MG患者)與門診患者(CSG患者)時間安排在不同的時間采集,MG患者于6：30-7：30am采集,CSG患者于9：00～10：30am采集,健康志愿者也分為這兩個時間段采集以確�？膳c患者組在同一時間段平行比較各指標。采集的唾液樣本經(jīng)離心后取上清液,-80℃保存?zhèn)溆谩?.3 sAA活性檢測采用Bernfeld方法檢測sAA活性,同時計算sAA活性比值(酸負荷后sAA活性／酸負荷前sAA活性)。2.4初步分析sAA活性比值與臨床癥候之間的關(guān)聯(lián)性通過逐步線性回歸分析法初步探討臨床癥候與sAA活性比值之間的關(guān)聯(lián)性。2.5健康者及各證型患者sAA糖基化程度研究采用western blot法,以人sAA生物標準品為參照,對比觀察健康者及各證型患者sAAN-糖蛋白表達,分析各證型患者sAAN-糖基化蛋白缺失情況。2.6 sAAN-糖鏈亞型構(gòu)成比分析檢測健康者及MG與CSG各證型患者與刀豆凝集素(conA)及麥胚凝集素(WGA)結(jié)合前后的sAA活性,并按公式：與凝集素的結(jié)合率=[(結(jié)合前sAA活性-結(jié)合后sAA活性)／結(jié)合前sAA活性]×100%,計算sAA與conA及WGA的結(jié)合率；進一步以conA與WGA進行凝集素親和層析實驗,分析N-糖鏈中高甘露糖型、雜合型及復(fù)合型糖鏈的構(gòu)成比情況。2.7植物凝集素的篩選定制凝集素芯片,篩選出與健康組、MG脾氣虛證及脾虛濕熱證患者sAA結(jié)合區(qū)別較大的凝集素,并再次以lectin Blot法進行驗證,為下一步深入研究sAAN糖鏈類型研究打下基礎(chǔ)。研究結(jié)果1.受試者一般資料CSG患者101例,年齡21-60歲,平均年齡40.1±12.1歲,男性44例,女性57例,其中脾氣虛證患者36例,脾虛濕熱證患者40例,肝胃不和證患者40例；MG患者61例,年齡20-65歲,平均48.1±14.7歲；男性24例,女性37例,其中脾氣虛證患者33例,脾虛濕熱證患者23例,脾腎虧虛證患者5例(因脾腎虧虛證患者例數(shù)較少,故暫未分析其指標)。健康志愿者36例,年齡20-35歲,平均年齡28.3±5.8歲。2.CSG與MG各證型患者臨床癥候結(jié)果CSG脾氣虛證患者以舌淡、脈浮細弱、唇色暗淡、呃逆、食后腹脹、身重困倦、噯氣、腸鳴音亢進、脘腹疼痛、肢體倦怠、大便溏泄等癥出現(xiàn)頻率較高；脾虛濕熱型患者以舌紅、脈沉濡數(shù)、唇色暗淡、胃脘脹滿、食后腹脹、身重困倦、噯氣、呃逆等癥多見；肝胃不和型主癥表現(xiàn)為：脈弦,舌淡,脘腹脹滿或疼痛、噯氣、情志抑郁等癥。其中脾氣虛證患者食后腹脹、呃逆、口泛清涎、舌淡、脈浮細弱等癥的出現(xiàn)顯著頻率高于脾虛濕熱證及肝胃不和證患者(P0.01)。MG脾氣虛證患者多見脈浮細弱、舌淡、眼瞼下垂、表情呆板、四肢無力、眼球活動不靈活、多汗、面色晦暗、神疲懶言、食欲減退等癥；脾虛濕熱證患者多見脈沉濡弱、多汗、咀嚼無力、表情呆板、四肢無力、面色晦暗、身重困倦、渴欲飲水等癥。脾氣虛證患者食欲減退、口泛清涎、舌淡、脈浮細弱、眼瞼下垂、眼球活動不靈活等癥的出現(xiàn)頻率顯著高于脾虛濕熱證(P0.01),此結(jié)果可為進一步探討脾氣虛證臨床癥候與sAA活性比值之間關(guān)系的基礎(chǔ)。3.sAA活性檢測結(jié)果健康志愿者酸負荷后sAA活性升高,CSG、MG脾氣虛組與脾虛濕熱組患者酸負荷后sAA活性下降,CSG肝胃不和組患者酸負荷后sAA活性升高；CSG、MG脾氣虛證及脾虛濕熱證患者sAA活性比值(酸負荷后/酸負荷前)與健康組相比明顯降低(P0.05),CSG肝胃不和組患者sAA活性比值與健康組相比無差異。提示脾虛病理狀態(tài)(包括脾虛濕熱)在酸負荷前sAA活性可代償性升高,而應(yīng)激力下降,導(dǎo)致在酸負荷后sAA活性的下降,sAA活性比值降低。4.臨床癥狀與sAA活性比值的關(guān)聯(lián)性結(jié)果通過逐步線性回歸分析發(fā)現(xiàn)CSG脾氣虛證患者sAA活性比值與食后腹脹、脘腹疼痛、呃逆三個癥候關(guān)聯(lián)性較大,且均呈負相關(guān)；MG脾氣虛證患者sAA活性比值與口泛清涎、食欲減退、眼瞼下垂三個癥候關(guān)聯(lián)性較大,且呈負相關(guān)。CSG、MG其它證型均未發(fā)現(xiàn)與sAA活性比值有明顯相關(guān)性的癥候。因此提示脾氣虛證患者的某些臨床癥候與sAA活性比值之間的關(guān)系較其它證型更為密切。5. sAAN-糖基化研究5.1 sAAN-糖基化程度分析56.7%(17/30)的MG脾氣虛患者與36.4%(8/22)的MG脾虛濕熱患者出現(xiàn)sAAN-糖基化蛋白表達缺失,明顯高于健康組的11.1%(4/36)(P0.05),25.0%(8/32)CSG脾氣虛證及31.7%(13/41)的CSG脾虛濕熱證出現(xiàn)sAAN-糖基化蛋白表達缺失,明顯高于健康組的11.1%(P0.05),而CSG肝胃不和證患者sAA N-糖基化蛋白缺失比例為8.7%(2/23),與健康者無差異,提示脾氣虛證及脾虛濕熱證患者sAAN-糖基化蛋白表達缺失是sAA活性改變的病理背景之一。5.2 sAA N-糖鏈亞型結(jié)構(gòu)分析結(jié)果5.2.1各組sAA與conA及WGA結(jié)合率結(jié)果比較sAA與conA及WGA結(jié)合率比較結(jié)果顯示,MG脾氣虛組、脾虛濕熱組與CSG脾氣虛組、脾虛濕熱組患者酸負荷前、后sAA與conA的結(jié)合率均明顯高于健康者組(P0.05),提示脾氣虛證及脾虛濕熱證患者sAA中高甘露糖型及雜合型(生物活性較弱)蛋白構(gòu)成比高于健康者組；MG脾氣虛組、脾虛濕熱組及CSG脾氣虛組、脾虛濕熱組患者酸負荷前、后sAA與WGA結(jié)合率均低于健康組(P0.05),說明復(fù)合型糖鏈(生物活性較強)的構(gòu)成比低于健康組,CSG肝胃不和組患者sAA與conA及WGA的結(jié)合率與健康組相比均無明顯差異,說明實證患者sAA糖鏈結(jié)構(gòu)無明顯改變。5.2.2各組sAA與conA及WGA親和層析結(jié)果比較MG、CSG脾氣虛組及脾虛濕熱組患者sAA與conA親和層析結(jié)果分別顯示弱結(jié)合峰面積與強結(jié)合峰面積峰面積高于未結(jié)合峰面積峰面積,說明脾氣虛組及脾虛濕熱組患者sAA中高甘露糖及雜合型糖鏈構(gòu)成比大于復(fù)合型糖鏈。MG、CSG脾氣虛組與脾虛濕熱組患者sAA與WGA親和層析結(jié)果顯示,脾氣虛組患者未結(jié)合峰面積高于結(jié)合峰面積,脾虛濕熱組患者結(jié)合峰面積高于未結(jié)合峰面積,說明脾氣虛組患者sAA中復(fù)合型糖鏈構(gòu)成比降低,脾虛濕熱證患者sAA中雜合型與復(fù)合型糖鏈構(gòu)成比升高。綜合sAA與conA層析結(jié)果可推測脾氣虛組患者sAA中生物活性較弱的高甘露糖型糖鏈構(gòu)成比較高,脾虛濕熱組患者sAA中雜合型糖鏈構(gòu)成比較高。結(jié)果提示, N-糖鏈中生物活性較弱的高甘露糖型糖鏈含量升高、生物活性較強復(fù)合性糖鏈含量降低是sAA活性下降的因素之一。6.其他植物凝集素的篩選6.1 LectinTM凝集素芯片結(jié)果與健康組相對照,發(fā)現(xiàn)番茄凝集素(LEL)、馬鈴薯凝集素(STL)與麥胚凝集素(WGA)3個凝集素在健康組、重癥肌無力脾氣虛證及脾虛濕熱證患者唾液樣本中具有一定的區(qū)分能力,其中WGA在3組樣本中表現(xiàn)出較大的差異�？蛇M選用這三種凝集素進行下一步的深入研究。6.2凝集素芯片驗證結(jié)果通過Lectin blot實驗發(fā)現(xiàn)脾虛濕熱證患者sAA與WGA、LEL、STL結(jié)合的糖蛋白表達均高于健康者,比較三種凝集素結(jié)合糖鏈特異性可推斷本組MG脾虛濕熱證患者sAA中含有GlcNAc糖鏈結(jié)構(gòu)增多。提示W(wǎng)GA、LEL、STL所結(jié)合的糖蛋白在健康者與MG脾虛濕熱者之間有明顯的區(qū)分能力,可用于進一步深入研究sAA糖鏈結(jié)構(gòu)類型。研究結(jié)論：重癥肌無力及慢性淺表性胃炎脾氣虛證(虛證)與脾虛濕熱證(虛實夾雜)患者在酸負荷后均表現(xiàn)為sAA活性下降,sAA活性比值降低(1),N-糖基化蛋白缺失及N-糖鏈構(gòu)成比的改變可能是影響sAA活性變化的主要因素之一。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R259

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本文編號：1757188