本文選題：“腎生髓、髓生血”　切入點：地中海貧血　出處：《中國中醫(yī)科學(xué)院》2016年博士論文

【摘要】：β地中海貧血(簡稱β地貧),屬于常染色體隱性遺傳血紅蛋白病。地貧廣泛分布于熱帶、亞熱帶。地中海以及東南亞地區(qū)(印度、泰國、印度尼西亞)是地貧的高發(fā)區(qū),中國地貧高發(fā)區(qū)主要分布在南方廣西、廣東。地貧是在世界范圍內(nèi)發(fā)病率高、危害大、致死率高的單基因遺傳病,重型和中間型地貧患兒的出生是世界公認的公共衛(wèi)生問題�，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)目前尚未找到根治大量新生地貧患兒的解決方案,如何提高這類人群的生存質(zhì)量是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)亟待解決的問題。地貧發(fā)病機制明確,但對其治療相對滯后。導(dǎo)師吳志奎教授基于“腎生髓、髓生血”理論,用“補腎益髓”法在地貧高發(fā)區(qū)治療β地貧取得了肯定療效。積累了30多年臨床實踐,首次對地貧的中醫(yī)理論認識、核心病機、中醫(yī)藥治療地貧的治則治法和療效作用的可能機制提出了較明確的認識。創(chuàng)建了系統(tǒng)的理論與有效治法,填補了植物藥治療地貧的臨床空白,擴大了中醫(yī)藥治療單基因遺傳病的國際影響。本論文的主要內(nèi)容是在深入學(xué)習(xí)傳承導(dǎo)師“補腎益髓”治療地貧理論和臨床實踐經(jīng)驗,總結(jié)前期工作的基礎(chǔ)上,首次在高發(fā)區(qū)開展“補腎益髓”治療β地貧隨機、雙盲、安慰劑對照規(guī)范臨床研究并對其療效的可能機制提出研究假說,認為“補腎益髓”治療地貧發(fā)揮療效的可能機制是通過改善造血微環(huán)境,調(diào)控骨髓造血干細胞增殖分化、影響DNA甲基化表觀遺傳修飾,進而促進骨髓有效造血實現(xiàn)的。通過分離培養(yǎng)骨髓造血干細胞、間充質(zhì)干細胞,采用RT-PCR檢測珠蛋白基因表達調(diào)控,利用Western blot,DNA甲基化芯片,透射電鏡等現(xiàn)代生物信息學(xué)技術(shù),體內(nèi)外實驗相結(jié)合,驗證假說的客觀性。一、研究目標開展補腎益髓治療β地貧臨床規(guī)范研究;并從改善造血微環(huán)境,調(diào)控骨髓造血干細胞增殖分化,影響DNA甲基化修飾等方面對其促進骨髓有效造血的療效機制進行深入研究,側(cè)面揭示“腎生髓、髓生血”的理論內(nèi)涵。本項課題圍繞著研究目標從臨床和實驗兩個部分展開研究。1補腎益髓治療地貧的臨床研究1.1地貧患者中醫(yī)證候分布規(guī)律調(diào)查調(diào)查中醫(yī)腎虛證候(腎精虧虛證、腎陰虛證、腎陽虛證)在地貧患者中的具體分布,中醫(yī)腎虛癥候積分與基因型的關(guān)系以及在地貧患者中的差異,為益髓生血顆粒臨床辨證治療地貧提供依據(jù)。1.2益髓生血顆粒治療β地貧臨床規(guī)范研究采用隨機對照試驗(隨機雙盲安慰劑平行對照),臨床試驗前在國際臨床研究注冊網(wǎng)站進行注冊。對治療前后患者的中醫(yī)癥候量化評分,連續(xù)觀察血液指標動態(tài)變化,以國際公認的診斷與療效標準,采用第三方統(tǒng)計分析對治療結(jié)果進行評價。2補腎益髓治療地貧的機制研究主要圍繞著益髓生血顆粒治療地貧改善骨髓造血微環(huán)境,調(diào)控骨髓造血干細胞增殖分化以及影響DNA甲基化表觀遺傳修飾,進而促進骨髓有效造血展開。2.1地貧患者內(nèi)源性骨髓造血干細胞增殖通過觀察患者內(nèi)源性骨髓造血干細胞增殖,益髓生血顆粒含藥血清及組分單體對造血干細胞集落分化、珠蛋白基因表達及蛋白含量的影響,探討“補腎益髓”治療地貧調(diào)控造血干細胞增殖分化的機制。同時對益髓生血顆粒治療兩對雙胞胎地貧患兒進行個體研究,觀察遺傳背景與臨床療效、骨髓造血干細胞增殖的關(guān)系。2.2益髓生血顆粒改善骨髓造血微環(huán)境調(diào)控骨髓有效造血通過檢測益髓生血顆粒治療地貧對骨髓血血漿細胞因子活性,紅細胞免疫酶活性,以及對間充質(zhì)干細胞增殖、分泌細胞因子活性與基因表達,觀察補腎益髓治療地貧對造血微環(huán)境調(diào)控的影響。2.3益髓生血顆粒治療地貧對DNA甲基化修飾的影響通過對益髓生血顆治療β地貧有效病例進行全基因組DNA甲基化分析,探討益髓生血顆粒治療地貧對DNA甲基化表觀遺傳修飾的影響,從表觀遺傳修飾方向?qū)ふ遗c造血相關(guān)的功能基因。二、研究方法及結(jié)果1 臨床研究方法及結(jié)果1.1地貧患者中醫(yī)證候分布規(guī)律調(diào)查采集地貧患者臨床基礎(chǔ)數(shù)據(jù),制定地貧流行病學(xué)調(diào)查表。調(diào)查299例地貧患者(腎虛證)基因型,對中醫(yī)證候進行分類(腎精虧虛證、腎陰虛證、腎陽虛證),對26項中醫(yī)癥候進行評分匯總。對不同基因型地貧的中醫(yī)證候,癥候積分進行統(tǒng)計分析,觀察中醫(yī)證候在地貧患者中的分布。地貧患者中醫(yī)證候調(diào)查結(jié)果顯示,在調(diào)查的所有患者中,以腎陰虛證195例最為多見,其次為腎精虧虛證89例,腎陽虛證所占比例較少。涉及的26項中醫(yī)腎虛癥侯出現(xiàn)的頻率以面色萎黃、盜汗、口唇淡白、神疲乏力、咽干、口干多見,地貧患者陰血虧虛見面色萎黃、口唇淡白；血虛則氣弱,神疲乏力；陰虛則見盜汗、口干、咽干。β地貧患者基因型為純合子或雜合子的腎虛癥候積分無統(tǒng)計學(xué)差異。1.2益髓生血顆粒治療β地貧高發(fā)區(qū)臨床規(guī)范研究采用隨機、雙盲、安慰劑平行對照方法,試驗前在國際臨床研究網(wǎng)站進行注冊(https://clinicaltrials.gov/,NCT01549080),對患者中醫(yī)癥候量化評分,動態(tài)觀察臨床血液指標變化,由第三方編盲與第三方統(tǒng)計,以國際公認的診斷與療效標準,對臨床治療結(jié)果進行評價。入組40例β地貧患者,隨機分為實驗組和對照組,實驗組給予益髓生血顆粒,對照組給予安慰劑,療程12周。治療前和治療第4周、8周、12周分別對患者外周血Hb.RBC、Ret、HbF、WBC、PLT進行檢測,以Hb上升≥5g/L為臨床治療有效病例。益髓生血顆粒治療β地貧結(jié)果顯示,治療第4周、8周、12周實驗組有效率分別為47.06%,47.06%和58.82%；對照組有效率分別為11.11%,5.56%,5.56%；兩組有效率比較,三個時間點實驗組與對照組有效率比較均有顯著的統(tǒng)計差異(4周p0.05,8周p0.01,12周p0.01)。該研究在國內(nèi)外β地貧臨床研究中為首次完成。組內(nèi)自身比較,實驗組治療第4周,Hb和RBC上升,與療前比較差異有統(tǒng)計意義(p0.01)；治療第8周HbF上升,與療前比較上升有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01)；對照組Hb上升沒有統(tǒng)計意義。治療12周,實驗組Hb平均水平71.35g/L,高于對照組平均水平68.50g/L,組間各指標比較差異沒有統(tǒng)計意義。益髓生血顆粒能夠提高患者Hb、RBC、HbF的含量,對患者WBC和PLT的作用效果不明顯。2實驗研究方法及結(jié)果2.1益髓生血顆粒治療地貧對患者骨髓造血干細胞增殖的影響選取經(jīng)益髓生血顆粒治療的5例地貧患者,其中有2對雙胞胎患兒(同卵雙生β地貧患兒,異卵雙生α地貧患兒),療程12周。治療前后取患者骨髓血,經(jīng)淋巴細胞分離液密度梯度離心分離有核細胞,采用磁性分選器經(jīng)免疫磁珠陽性分選獲得骨髓CD34+細胞,對治療前后骨髓CD34+細胞進行體外連續(xù)培養(yǎng),采用CCK8法檢測細胞第2、4、6、7日各時間點的OD值,對兩對雙胞胎地貧患兒的遺傳背景與療效,與骨髓CD34+細胞的增殖能力進行初步分析。(1)研究顯示,5例患者療后骨髓CD34+細胞體外培養(yǎng)自第2日開始,增殖較快,至第7日療后CD34+細胞增殖OD值為0.62,較療前骨髓CD34+細胞增殖明顯提高(p0.01)。提示益髓生血顆粒治療地貧可顯著促進患者內(nèi)源性骨髓CD34+細胞增殖。(2)研究還對不同類型(α型,β型)的兩對雙胞胎地貧患兒,進行了遺傳背景與臨床療效、骨髓CD34+細胞的增殖能力關(guān)系的比較分析。1)結(jié)果發(fā)現(xiàn),同卵雙生β地貧患兒(基因型p41-42/β8)與異卵雙生α地貧患兒(基因型--SEA/αCSα,--SEA/α4.2α),遺傳背景不同其臨床療效及骨髓CD34+細胞的增殖能力有明顯差異。α型地貧雙胞胎患兒較β型地貧雙胞胎患兒臨床貧血癥狀輕,經(jīng)益髓生血顆粒治療后,療效優(yōu)于β地貧雙胞胎患兒；α地貧雙胞胎患兒骨髓CD34+細胞的增殖能力高于β型地貧雙胞胎患兒。2)β地貧遺傳背景完全相同(基因型β 41-42/β-28),骨髓CD34+細胞體外增殖情況個體差異較大,在臨床貧血較輕的患者,其骨髓CD34+細胞的增殖能力較強。α地貧患兒療后骨髓CD34+細胞增殖能力隨時間變化提高明顯,基因型--SEA/αCSα(缺失、突變)患兒骨髓CD34+細胞增殖能力較基因型--SEA/α42α(缺失型)患兒更為明顯。上述研究結(jié)果在中藥治療地貧研究中為首次完成。2.2益髓生血顆粒含藥血清誘導(dǎo)紅系分化研究研究通過半固體集落培養(yǎng)方法,觀察益髓生血顆粒含藥血清高、中、低各濃度對骨髓CD34+細胞分化集落的影響；同時以K562細胞為研究對象,用益髓生血顆粒含藥血清培養(yǎng)K562細胞,采用聯(lián)苯胺染色和RT-PCR技術(shù)觀察益髓生血顆粒誘導(dǎo)K562細胞向紅系分化的作用。結(jié)果顯示益髓生血顆粒含藥血清作用第13天,BFU-E集落數(shù)量與對照組比較,高劑量組呈現(xiàn)明顯的促進集落分化的作用(p0.001)；低劑量組與中劑量組集落數(shù)高于對照組,但差異無統(tǒng)計意義(p0.05)。益髓生血顆粒高劑量含藥血清能夠促進K562細胞a和γ珠蛋白基因表達(p0.05)。2.3益髓生血顆粒君藥單體對骨髓造血干細胞分化集落形成的影響研究以君藥制首烏組分二苯乙烯苷和大黃素作用骨髓CD34+細胞,觀察細胞集落分化形成,采用RT-PCR和Western blot技術(shù)檢測造血干細胞早期分化集落細胞各珠蛋白(α、β、γ、ε)的基因表達和蛋白含量。研究結(jié)果顯示,大黃素9.25μM濃度組CFU-E集落數(shù)為33.67,3.70μM濃度CFU-E集落數(shù)為25.00,與對照組17.00比較差異均有統(tǒng)計意義(p0.05)。取培養(yǎng)第13天集落細胞,珠蛋白基因表達結(jié)果顯示大黃素9.25μM組能夠促進早期分化集落細胞中γ珠蛋白基因表達(p0.05),Western blot結(jié)果表明大黃素能夠提高骨髓CD34+細胞分化集落細胞β和γ珠蛋白含量。2.4益髓生血顆粒治療地貧患者對骨髓血中細胞因子活性的影響取益髓生血顆粒治療患者前后骨髓血,密度梯度離心收集骨髓血血漿、紅細胞,采用酶聯(lián)免疫、透射電鏡等實驗技術(shù)檢測益髓生血顆粒對骨髓血內(nèi)造血細胞因子以及免疫相關(guān)酶活性的影響。研究結(jié)果顯示,益髓生血顆粒治療12周,骨髓血中細胞因子SCF、G-CSF、 IL-6、EPO含量呈上升的趨勢；骨髓血紅細胞氧化相關(guān)酶活性檢測,SOD和GSH-PX表現(xiàn)上升,MDA表現(xiàn)下降,治療后的外周血紅細胞內(nèi)包涵體數(shù)量明顯降低,結(jié)果提示：益髓生血顆�？商岣叩刎毣颊吖撬柚性煅嚓P(guān)細胞因子活性,提高抗氧化能力,減少紅細胞內(nèi)包涵體,改善造血微環(huán)境,促進有效造血。2.5益髓生血顆粒對骨髓間充質(zhì)干細胞增殖的影響研究取患者骨髓血,密度梯度離心獲得有核細胞,采用免疫磁珠陽性分選方法獲得骨髓CD34+細胞,同時將剩余細胞進行連續(xù)貼壁培養(yǎng),獲得骨髓間充質(zhì)干細胞。采用CCK8檢測大黃素和二苯乙烯苷對患者骨髓間充質(zhì)干細胞增殖影響。研究結(jié)果顯示,單體大黃素一定濃度能夠促進骨髓間充質(zhì)干細胞增殖,二苯乙烯苷一定濃度表現(xiàn)出促進增殖的作用趨勢。2.6益髓生血顆粒對骨髓間充質(zhì)干細胞分泌細胞因子活性與表達的影響連續(xù)貼壁培養(yǎng)獲得地貧患者骨髓間充質(zhì)干細胞,采用ELISA和RT-PCR實驗技術(shù)檢測君藥單體對患者骨髓間充質(zhì)干細胞自身分泌細胞因子SCF和IL-6活性和基因表達的影響。研究結(jié)果顯示,大黃素和二苯乙烯苷能夠提高細胞因子SCF活性,對IL-6活性影響不大；大黃素作用骨髓間充質(zhì)干細胞第八天,能夠促進SCF的基因表達(p0.05),二苯乙烯苷對細胞因子SCF和IL-6基因表達沒有影響。2.7益髓生血顆粒治療地貧患者對全基因組DNA甲基化的影響收集5例益髓生血顆粒治療有效的β地貧病例的外周血有核細胞,采用DNA甲基化芯片技術(shù),對治療前后的5例β地貧患者進行全基因組DNA甲基化測定。全基因組DNA甲基化研究結(jié)果顯示,位于11號染色體上的LGR4和PP11159H22.2基因,位于16號染色體上的CCDC101、NUPR1和RP1166602.1基因在治療后處于低甲基化功能,這些基因的作用與蛋白編碼有關(guān)。兩個關(guān)鍵基因JAK3和MAPK10,存在于骨髓和淋巴系統(tǒng),JAK3在早期造血過程中與造血細胞因子密切相關(guān)。三、研究結(jié)論本課題首先對地貧進行了中醫(yī)腎虛證候分布調(diào)查,在中醫(yī)證候調(diào)查的基礎(chǔ)上,首次開展益髓生血顆粒治療β地貧的隨機、雙盲、安慰劑對照臨床試驗,進行臨床研究國際注冊,以規(guī)范的臨床試驗研究驗證了益髓生血顆粒治療地貧的有效性；在臨床療效的基礎(chǔ)上,從骨髓造血干細胞增殖分化,骨髓造血微環(huán)境調(diào)控有效造血及DNA甲基化表觀遺傳層面對療效產(chǎn)生的分子機制進行了深入探討,得出以下結(jié)論：1臨床研究1.1α地貧和β地貧臨床均存在腎虛表現(xiàn),以腎陰虛證最為多見,基本證型為腎精血不足、腎陰虛證。1.2隨機、雙盲、安慰劑平行對照評價益髓生血顆粒治療地貧療效,療程結(jié)束,實驗組地貧患者治療4周、8周、12周有效率分別為47.06%,47.06%和58.82%；對照組有效率分別為11.11%,5.56%,5.56%;兩組各時間節(jié)點有效率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(第4周p0.05,第8周p0.01,第12周p0.01)。該研究在國內(nèi)外β地貧臨床研究中為首次完成。2療效機制研究2.1益髓生血顆粒能夠促進骨髓CD34+細胞增殖分化,促進骨髓有效造血：(1)益髓生血顆粒能夠促進地貧患者內(nèi)源性骨髓CD34+細胞體外增殖。地貧患者骨髓CD34+細胞的增殖具有時間依賴性,隨著作用時間的延長,療后骨髓CD34+細胞增殖能力顯著提高。(2)遺傳背景與臨床療效、骨髓CD34+細胞的增殖能力關(guān)系的比較,遺傳背景不同的兩對雙胞胎地貧患兒,其臨床療效及骨髓CD34+細胞的增殖能力有明顯差異；同類型雙胞胎患兒,同卵雙生β地貧患兒(基因型p41-42/β-28)療效有個體差異,對異卵雙生a地貧患兒(基因型--SEA/acsa,--SEA/α4.2α)基因型不相同療效也有明顯差異。(3)益髓生血顆粒含藥血清高劑量組促進骨髓CD34+細胞分化紅系集落形成,并能誘導(dǎo)K562細胞向紅系分化。(4)益髓生血顆粒組分大黃素能夠促進骨髓CD34+細胞分化集落細胞γ珠蛋白基因表達。2.2益髓生血顆粒能夠改善骨髓造血微環(huán)境,促進骨髓有效造血：(1)益髓生血顆粒能夠提高患者骨髓血血漿SCF、IL-6、G-CSF、EPO造血細胞因子含量,提高患者骨髓內(nèi)紅細胞SOD,GSH-PX酶活性。(2)組分單體大黃素能夠促進骨髓MSC細胞增殖。(3)大黃素能夠提高骨髓MSC細胞分泌細胞因子SCF的活性。(4)益髓生血顆粒治療β地貧有效病例全基因組DNA甲基化結(jié)果顯示,兩個關(guān)鍵基因JAK3和MAPK 10可能在細胞因子誘導(dǎo)干細胞分化過程中起作用。益髓生血顆粒能夠改善骨髓造血微環(huán)境,調(diào)控骨髓造血干細胞有效造血,表現(xiàn)為能夠促進骨髓MSC細胞自分泌細胞因子,減少早期紅系集落細胞氧化損傷,促進骨髓造血干細胞增殖,促進造血干細胞早期分化集落細胞Y珠蛋白的基因表達,促進有效造血。益髓生血顆粒緩解地貧患者臨床貧血癥狀的作用機制可能是促進骨髓有效造血,減少骨髓內(nèi)早期紅細胞的溶血。研究結(jié)果提示,“腎生髓、髓生血”理論的現(xiàn)代生物學(xué)內(nèi)涵可部分體現(xiàn)為骨髓微環(huán)境調(diào)控下的骨髓造血干細胞的增殖分化功能。四、論文創(chuàng)新之處1.本研究首次在高發(fā)區(qū)完成益髓生血顆粒治療β地貧的隨機、雙盲、安慰劑平行對照臨床試驗,進行臨床研究國際注冊,第三方編盲統(tǒng)計,以國際公認的診斷與療效標準,對益髓生血顆粒治療地貧進行療效評價,在國內(nèi)外β地貧臨床研究中屬于首次完成。2.研究發(fā)現(xiàn)益髓生血顆粒能夠促進地貧患者內(nèi)源性骨髓CD34+細胞體外增殖。對雙胞胎患兒研究發(fā)現(xiàn),遺傳背景與療效、患兒骨髓CD34+細胞增殖密切相關(guān),上述研究在中藥治療地貧療效機制研究中為首次完成。3.理論創(chuàng)新：論文基于補腎益髓治療β地貧的明顯療效,從促進患者內(nèi)源性造血干細胞增殖分化,改善造血微環(huán)境,誘導(dǎo)紅系分化及影響DNA甲基化表觀遺傳修飾層面,探討了補腎益髓治療β地貧療效的分子機制,從一個側(cè)面闡釋了“腎生髓、髓生血”理論的科學(xué)內(nèi)涵。研究結(jié)果為難治疾病防治的現(xiàn)代研究提供了新思路。
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【學(xué)位授予單位】：中國中醫(yī)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R259

【參考文獻】

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本文編號：1687378