本文關(guān)鍵詞： 桂枝芍藥知母湯 痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎 TLRs-MyD88 NLRP3炎性體 中性粒細(xì)胞 巨噬細(xì)胞 信號通路　出處：《湖北中醫(yī)藥大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:在探討桂枝芍藥知母湯(Guizhishaoyaozhimu Decoction,GD)治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎(Gouty Arthritis,GA)相關(guān)理論基礎(chǔ)上,基于TLRs-MyD88及NLRP3炎性體(NACHT-LRR-PYD-containing proteins3 inflammasome)信號通路,以GA相關(guān)的受體、信號銜接蛋白、炎性因子為觀察指標(biāo),用三個(gè)實(shí)驗(yàn)觀察GD對尿酸鈉踝關(guān)節(jié)注射致GA模型大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織及尿酸鈉混懸液誘導(dǎo)的大鼠中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞炎性信號表達(dá)的影響,以期探明GD治療GA的抗炎作用機(jī)制。方法:實(shí)驗(yàn)一采用尿酸鈉踝關(guān)節(jié)注射致GA大鼠模型方法,對比觀察秋水仙堿及GD給藥組對模型大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中炎性信號因子TLR-2、TLR-4、NLRP3、MyD88、ASC、Capase-1、Capase-12、IKK-β、IκB-α、PPAR-γ、IL-1β、TNF-α、IL-2、IL-6、IL-10、COX-2、TGF-β1、NF-κB表達(dá)的影響,實(shí)驗(yàn)二、三采用細(xì)胞藥理學(xué)方法,對比觀察秋水仙堿及GD給藥組對尿酸鈉混懸液誘導(dǎo)的大鼠中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞炎性信號TLR-2、TLR-4、NLRP3、MyD88、ASC、Capase-12、IKK-β、IκB-α、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、S100A8、NF-κB表達(dá)的影響。主要觀察指標(biāo)及檢測方法如下:⑴實(shí)驗(yàn)一180只雄性SD大鼠隨機(jī)分配到3個(gè)實(shí)驗(yàn),即關(guān)節(jié)滑膜IHC實(shí)驗(yàn)、ELISA實(shí)驗(yàn)、Westblot實(shí)驗(yàn)。各試驗(yàn)取大鼠60只,按體重隨機(jī)分為6組,每組10只,即模型對照組、正常對照組、GD中、高、低劑量組(4,8,16 g?kg-1)、秋水仙堿陽性對照組(3×10-4 g?kg-1)。實(shí)驗(yàn)組均灌胃給藥,正常與模型組給予等量蒸餾水,每天1次,連續(xù)7天。第5天灌胃前,大鼠足踝關(guān)節(jié)注射尿酸鈉懸液誘導(dǎo)GA。取大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織,IHC技術(shù)檢測受體TLR-2、TLR-4、NLRP3的表達(dá),Image-Pro Plus6.0圖像分析系統(tǒng)測定平均IOD,WesternBlot法檢測MyD88、ASC、Capase-1、Capase-12、IKK-β、IκB-α、PPAR-γ信號蛋白表達(dá)水平。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法(ELISA)測定炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-2、IL-6、il-10、cox-2、tgf-β1表達(dá)水平,dpi-elisa方法檢測nf-κb活性。⑵實(shí)驗(yàn)二、三大鼠30只,按體重隨機(jī)分為5組,每組6只,gd中、高、低劑量組(4,8,16g?kg-1)、秋水仙堿陽性對照組(3×10-4g?kg-1)均灌胃給藥,正常組給予等容積的蒸餾水,每天1次,連續(xù)給藥7天。最后一次灌胃1h后,所有大鼠乙醚麻醉,取血清備用。sd雄性大鼠各20只,參照文獻(xiàn)方法提取分離大鼠中性粒細(xì)胞與巨噬細(xì)胞,接種培養(yǎng)。細(xì)胞試驗(yàn)分為2個(gè)實(shí)驗(yàn)組(不加受體抑制劑,加nlrp3受體抑制劑),每個(gè)實(shí)驗(yàn)組均含6個(gè)組,正常對照組加入正常大鼠血清,模型對照組、中、高、低劑量組、秋水仙堿組全部滴加200μg·l-1的尿酸鈉混懸液造模,同時(shí)滴加含藥血清,置于co2細(xì)胞培養(yǎng)箱中,中性粒細(xì)胞孵育12h取出,巨噬細(xì)胞孵育2h取出。elisa法測定炎性因子il-1β、il-6、il-8、tnf-α、s100a8的表達(dá),dpi-elisa方法檢測nf-κb活性;westernblot法檢測myd88、asc、capase-12、ikk-β、iκb-α信號銜接蛋白表達(dá)水平;rt-pcr法觀測tlr-2、tlr-4、nlrp3mrna的表達(dá)。結(jié)果:⑴實(shí)驗(yàn)一造模72h后,大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中tlrs-myd88信號通路相關(guān)因子表達(dá)結(jié)果:與正常組比較,模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中tlr-2、tlr-4平均iod值、myd88、ikk-β、il-2、cox-2、il-10、nf-κb蛋白表達(dá)水平明顯升高(p0.05);iκb-α、ppar-γ、tgf-β1表達(dá)明顯降低(p0.05);與模型組比較,秋水仙堿組、gd中、高劑量(8,16g·kg-1)組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中tlr-2、tlr-4平均iod值、myd88、il-2、cox-2、il-10、nf-κb表達(dá)水平顯著降低(p0.05);gd中、高劑量組iκb-α、ppar-γ、tgf-β1表達(dá)明顯升高(p0.05),gd各劑量組ikk-β無明顯變化。gd中、高劑量組對myd88表達(dá)抑制作用明顯,秋水仙堿組比較有顯著差異(p0.05)。大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中nlrp3炎性體信號通路相關(guān)因子表達(dá)結(jié)果:與正常組比較,模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中nlrp3、asc、capase-1、il-1β、il-6、tnf-α、nf-κb表達(dá)明顯升高(p0.05),capase-12表達(dá)明顯降低(p0.05);與模型組比較,秋水仙堿組、gd中、高劑量組nlrp3、asc、gd各劑量組capase-1、il-1β、il-6、tnf-α、nf-κb表達(dá)水平均顯著降低(p0.05),gd中、高劑量組capase-12表達(dá)明顯升高(p0.05)。gd中、高劑量組對capase-12、tgf-β1表達(dá)上調(diào)作用明顯高于秋水仙堿組(p0.05)。⑵實(shí)驗(yàn)二中性粒細(xì)胞孵育12h后,細(xì)胞中tlrs-myd88信號通路相關(guān)因子表達(dá)結(jié)果:與正常組比較,模型組大鼠中性粒細(xì)胞中tlr-2、tlr-4mrna、myd88、ikk-β、il-1β、il-6、il-8、tnf-α、s100a8、nf-κb的表達(dá)水平明顯升高(p0.05);iκb-α表達(dá)水平明顯降低(p0.05);不加受體抑制劑實(shí)驗(yàn)中,與模型組比較,秋水仙堿組及gd各劑量組tlr-2、tlr-4mrna、myd88、ikk-β、il-1β、il-6、il-8、tnf-α、gd高劑量組nf-κb及秋水仙堿組s100a8表達(dá)均明顯降低(p0.05),gd高劑量組iκb-α、s100a8表達(dá)明顯升高(p0.05)。tlr受體抑制劑明顯抑制了中性粒細(xì)胞的tlr-2、tlr-4mrna、ikk-β、iκb-α、il-1β、il-6、il-8、nf-κb的表達(dá)。gd各劑量組中s100a8、iκb-α表達(dá)量顯著高于秋水仙堿組(p0.05)。中性粒細(xì)胞中nlrp3炎性體信號通路相關(guān)因子表達(dá)結(jié)果:與正常組比較,模型組大鼠中性粒細(xì)胞nlrp3mrna、asc(不加nlrp3受體抑制劑組)、il-1β、il-6、tnf-α、nf-κb表達(dá)水平明顯升高(p0.05),caspase-12表達(dá)水平明顯降低(p0.05);與模型組比較,給藥各組nlrp3mrna、il-1β、il-6、tnf-α及秋水仙堿組、gd高劑量組asc、gd中、高劑量組nf-κb表達(dá)均明顯降低(p0.05),gd中、高劑量組caspase-12表達(dá)明顯升高(p0.05),而秋水仙堿組caspase-12表達(dá)無明顯變化;nlrp3受體抑制劑明顯減少了中性粒細(xì)胞nlrp3mrna,il-1βil-6、tnf-α的表達(dá),但對nf-κb無明顯影響。gd中、高劑量組caspase-12表達(dá)明顯升高,與秋水仙堿組比較有顯著差異(p0.05)。⑶實(shí)驗(yàn)三巨噬細(xì)胞孵育2h后,細(xì)胞中tlrs-myd88信號通路相關(guān)因子表達(dá)結(jié)果:與正常組比較,模型組大鼠巨噬細(xì)胞中tlr-2、tlr-4mRNA、MyD88、IKK-β、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、S100A8、NF-κB表達(dá)水平明顯升高(P0.05);,IκB-α表達(dá)水平明顯降低(P0.05);不加受體抑制劑實(shí)驗(yàn)中,與模型組比較,給藥各組TLR-2、TLR-4 mRNA、MyD88、IKK-β及GD高劑量組及秋水仙堿組IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、NF-κB的表達(dá)均明顯降低(P0.05),GD高劑量組IκB-α、S100A8、TGF-β1表達(dá)明顯升高(P0.05)。TLR受體抑制劑明顯減少了巨噬細(xì)胞中TLR-2、TLR-4 mRNA、IκB-α、IL-1β、IL-8、TGF-β1的表達(dá)。GD各劑量組中S100A8、IκB-α表達(dá)量顯著高于秋水仙堿組(P0.05)巨噬細(xì)胞中NLRP3炎性體信號通路相關(guān)因子表達(dá)結(jié)果:細(xì)胞造模2h后,與正常組比較,模型組大鼠巨噬細(xì)胞中NLRP3 mRNA、ASC、IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB表達(dá)水平明顯升高(P0.05);Caspase-12表達(dá)水平明顯降低(P0.05)。與模型組比較,給藥各組NLRP3 mRNA、TNF-α及GD高劑量組ASC、IL-1β、IL-6、NF-κB表達(dá)均明顯降低(P0.05),GD中、高劑量組Caspase-12表達(dá)明顯升高(P0.05),且與秋水仙堿組比較有顯著差異(P0.05)。NLRP3受體抑制劑明顯抑制了巨噬細(xì)胞NLRP3 mRNA、ASC、Caspase-12、IL-1β的表達(dá),但對NF-κB活性無明顯影響。結(jié)論:三個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致表明:GD治療GA的作用機(jī)制可能與降低TLR-2、TLR-4、NLRP3受體及MyD88、ASC蛋白表達(dá),增加PPAR-γ、IκB-α表達(dá),抑制IL-1β分化成熟及NF-κB活化,降低Toll-MyD88及NLRP3炎性體信號通路炎性因子表達(dá)有關(guān)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析提示:與秋水仙堿組不同的是,GD能夠上調(diào)模型大鼠組織細(xì)胞中IκB-α、PPAR-γ、TGF-β1、Capase-12表達(dá),說明GD可能通過提高抗炎調(diào)控因子的表達(dá)負(fù)反饋抑制炎性信號通路所介導(dǎo)的GA炎性反應(yīng)。
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【學(xué)位授予單位】：湖北中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R259
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本文編號：1503870