本文關(guān)鍵詞：益氣活血解毒方調(diào)控Tregs相關(guān)SNPs位點治療氣虛血瘀型晚期卵巢癌的研究　出處：《中國中醫(yī)科學(xué)院》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：由于卵巢癌的早期癥狀不明顯且缺乏特異性,其早期診斷的技術(shù)也一直未見提高,患者發(fā)現(xiàn)時一般已處于晚期階段,雖然對其治療方法一直在探索,其標(biāo)準(zhǔn)治療手術(shù)加化療的方案也一直在精進,但其效果差強人意,尚未取得令人滿意的療效,而且該病發(fā)病后容易復(fù)發(fā),故卵巢癌一直是女性健康的一大殺手。臨床數(shù)據(jù)顯示約70%的卵巢癌患者在發(fā)現(xiàn)時已為晚期,但是目前,行最大程度的滿意的腫瘤細胞減滅術(shù)聯(lián)合鉑類與紫杉醇類藥物的一線化療方案仍為其標(biāo)準(zhǔn)治療。近幾十年來,隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷進步、發(fā)展以及化療藥物的發(fā)現(xiàn)和使用,手術(shù)和化療已經(jīng)有了很大的進步,但據(jù)美國流行病學(xué)和數(shù)據(jù)庫顯示,近三十年來晚期卵巢癌的5年生存率仍未見明顯的改善、提高。近年來,中醫(yī)藥對于卵巢癌患者的治療得到了人們的關(guān)注,無論是在延長患者的無進展生存期、提高患者的生活質(zhì)量、改善放化療產(chǎn)生的副反應(yīng)方面都得到了大家的認可。經(jīng)過前期臨床研究我們發(fā)現(xiàn):晚期卵巢癌患者的中醫(yī)臨床證型以氣虛證和血瘀證等證為主要證型。故我的導(dǎo)師盧雯平教授針對該類型的患者運用自擬益氣活血解毒方進行臨床辨證治療,該方是在近現(xiàn)代名中醫(yī)張錫純用以治療婦科腫瘤名方“理沖湯”的基礎(chǔ)之上,結(jié)合我科名老中醫(yī)孫桂芝教授、樸炳奎教授的經(jīng)驗進行加減而成的有效的抗腫瘤驗方,主要的藥物組成是:黃芪、山藥、白術(shù)、枸杞子、女貞子、莪術(shù)、三棱、青皮、海藻、青蒿、白花蛇舌草、穿山甲、全蟲,黃芪補氣力量最強,效果最好,為方中益氣主要藥物,山藥、白術(shù)健脾氣,升清氣,培補后天之氣,故而能夠從根本上調(diào)節(jié)人體氣的生成,同時達到治病必求于本的目的。氣為血之帥,血為氣之母,補氣的同時也要注重補人體之精血,使得氣血相和,不致偏頗,故加入枸杞子、女貞子等補血養(yǎng)精之品。莪術(shù)、三棱、青皮、海藻、穿山甲、全蟲等物具有活血行氣、軟堅散結(jié)之功能,益氣的同時注重活血行氣。青蒿、白花蛇舌草則以清熱解毒為主要功用。綜上所述,理沖湯消補兼施,扶正祛瘀,加入蟲類藥取其久病入絡(luò),增加活血通絡(luò)散結(jié)之力,加一些清化之品白花蛇舌草、青蒿取其本病日久易化熱化火傷津之意。Tregs細胞是現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)對卵巢癌研究的新視角,現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)腫瘤的病理機制多與免疫系統(tǒng)相關(guān),而Tregs細胞就是免疫系統(tǒng)中與免疫相關(guān)的重要一環(huán)。免疫治療被認為是突破現(xiàn)有治療的最有希望療法,但腫瘤微環(huán)境中復(fù)雜的免疫抑制分子機制及缺乏對卵巢癌個體免疫差異的認識,使得其在臨床未取得明顯進展。最新研究表明,調(diào)節(jié)T細胞(Tregs)是卵巢癌腫瘤微環(huán)境復(fù)雜免疫網(wǎng)絡(luò)中調(diào)控免疫逃逸和血管生成的關(guān)鍵免疫抑制因子,其相關(guān)基因的多態(tài)性(SNPs)與卵巢癌預(yù)后密切相關(guān),研究Tregs細胞的發(fā)生機制與卵巢癌的關(guān)系對臨床制定卵巢癌的治療方案具有積極作用。CD24參與細胞的粘附和轉(zhuǎn)移,被證實是血小板和內(nèi)皮細胞的粘附受體,導(dǎo)致了腫瘤細胞在血液中的轉(zhuǎn)移,被認為是一種新的致癌因子,也是腫瘤診斷和預(yù)后的重要標(biāo)志,且有相關(guān)研究表明CD24與Tregs發(fā)揮免疫功能具有相關(guān)性。通過臨床的前期研究我們發(fā)現(xiàn)益氣活血解毒方可以調(diào)節(jié)外周血中Tregs的水平,增強晚期卵巢癌患者機體的免疫力,從而降低其免疫抑制的作用,緩解患者的臨床癥狀,同時有效提高其生活質(zhì)量。初步實驗研究也發(fā)現(xiàn)益氣活血解毒中藥聯(lián)合DC疫苗對小鼠移植瘤生長有抑制作用,其療效的發(fā)揮與免疫抑制因子TGFβ1和IL-10有關(guān),而這兩種細胞因子來源于Tregs。故而我們推測該方延長氣虛血瘀型晚期卵巢癌生存可能與調(diào)控Tregs相關(guān)的免疫有關(guān)。擬從Tregs切入,采用SNPs及mRNA芯片技術(shù),用以探究與辨證論治療效有關(guān)的Tregs相關(guān)基因的多態(tài)(SNPs)特點及該方對對應(yīng)標(biāo)志基因表達的影響,方證與療效相結(jié)合,從而探索晚期卵巢癌氣虛血瘀證型的基因多態(tài)性的特點以及其中藥干預(yù)機制,為中藥個體化治療提供實驗研究依據(jù)。目的:1篩選出與益氣活血解毒方療效相關(guān)的SNPs位點;2探究益氣活血解毒方對差異SNPs對應(yīng)的基因mRNA表達的影響。方法:本研究共入組300例晚期卵巢癌患者,證候辨證為氣虛血瘀型。服益氣活血解毒方半年后抽取外周血10～15ml,運用Illumina Human Exome-12v1-1芯片,從300例氣虛血瘀型晚期卵巢癌患者的血液中提取DNA(TIANGEN TIANamp Blood DNA Kit),對樣品的gDNA進行濃度和純度檢測后進行全基因組的擴增、雜交,雜交后,通過清洗去掉非特異性結(jié)合的DNA,剩下特異性結(jié)合的位點進行單堿基延伸,染色后利用Illuminai Scan Reader進行掃描,將iScan系統(tǒng)掃描得到的原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入Illumina官方軟件GenomeStudio Genotyping模塊中,利用該模塊進行數(shù)據(jù)分析。運用 GeneChip(?)PrimeView TM Human Gene Expression Array芯片,從氣虛血瘀型晚期卵巢癌患者的血液中提取mRNA。觀察患者的無進展生存期(PFS),并對其進行癌抗原125(CA125)數(shù)值的記錄及生活質(zhì)量的療后評估,根據(jù)患者的中位無進展生存期將患者分為2組,一組為中藥有效組,其PFS中位無進展生存,另一組為中藥無效組,其PFS≤中位無進展生存。通過有效組和無效組SNPs比較,篩出顯著差異的SNPs位點,即可能對中藥敏感的SNPs位點,GO分析:將顯著差異的SNPs位點定位得到基因利用GO數(shù)據(jù)庫做功能富集,得到顯著的GO功能類別,Pathway分析:得到的基因利用KEGG數(shù)據(jù)庫做功能富集,得到差異基因顯著富集的生物通路;有效組和無效組mRNA表達的比較,篩選出差異表達的基因,同上,進行GO分析和Pathway分析,得到差異顯著的GO功能類別跟生物通路;將SNPs位點定位所得的基因與差異表達基因取交集,發(fā)現(xiàn)中藥干預(yù)的標(biāo)志基因。結(jié)果:1篩選出具有顯著性差異的SNPs位點1773個,位于外顯子上的SNPs位點共有1033個,非同義突變的SNPs位點有970個;對差異表達基因進行GO富集分析,發(fā)現(xiàn)與免疫相關(guān)的GO號有:GO:0006955、GO:0045087,其中GO:0006955與機體的免疫應(yīng)答有關(guān),GO:0045087與先天性的免疫反應(yīng)有關(guān),富集到GO:0006955上的基因有18個,具體為:FYB,RGS1,SUSD2,FCGRT,IL18RAP,CR2,IFI44L,CD96,C8A,CD 1C,CXCR5,IL16,SEMA4D,PDCD1LG2,HLA-DMA,MICA,PKHD1L1,HLA-DPA1;富集到GO:0045087 上的基因有 24個,具體是 TAB2,FCN1,MAP3K1,GAB1,DTX4,VNN1,CR2,FOXO3,WIPF3,ITPR2,F12,TRAF3,CD 180,EGF,NLRC5,C8A,NLRP4,IFI16,TLR3,FRS2,CD14,CD19,BPIFB3,DEFB132。對變異位點基因KEGG富集分析得到有顯著差異的通路14條,主要涉及嗅覺傳導(dǎo),酪氨酸代謝,糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨生物合成,脂肪酸的降解,精氨酸和脯氨酸代謝,β-丙氨酸代謝,莨菪烷類、哌啶、吡啶生物堿生物合成,丙酮酸代謝,長期的壓抑,黃酮和黃酮醇的生物合成,苯丙氨酸代謝,PPAR信號通路,堿基切除修復(fù),味覺傳導(dǎo)等信號通路。2通過對mRNA差異表達分析,得到顯著差異基因158個,其中上調(diào)基因58個,下調(diào)基因100個,通過上調(diào)的差異基因的GO分析發(fā)現(xiàn)在生物學(xué)功能領(lǐng)域與免疫相關(guān)的GO號6個,GO:0002227、GO:0006955、GO:0002842、GO:0002768、GO:0050776、GO:0050777,GO:0002227,它們與粘膜上的先天免疫應(yīng)答、免疫應(yīng)答、正向調(diào)控T細胞對腫瘤細胞的免疫調(diào)節(jié)、免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)細胞表面受體信號通路、免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)的生物學(xué)功能有關(guān);通過下調(diào)的差異基因的GO分析發(fā)現(xiàn)在生物學(xué)功能領(lǐng)域與免疫相關(guān)的GO號有10個,GO:0002566,GO:0002684,GO:0002741,GO:0002925,GO:0002309,GO:0002827,GO:0002218,GO:0045087,GO:0045824,GO:0002286,它們與體細胞突變導(dǎo)致的免疫受體多元化、免疫系統(tǒng)的正向調(diào)節(jié)、免疫反應(yīng)中細胞因子的分泌調(diào)節(jié)、循環(huán)免疫球蛋白介導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)、免疫應(yīng)答、輔助T細胞Ⅰ型的免疫反應(yīng)、先天免疫反應(yīng)的激活、先天免疫應(yīng)答、先天免疫反應(yīng)的負調(diào)節(jié)、免疫反應(yīng)中T細胞的激活有關(guān)。mRNA差異基因上調(diào)Passway富集得到8條相關(guān)的通路,主要涉及哮喘,瘧疾,造血細胞系,TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,Toll樣受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,吞噬體,異體移植排斥,腫瘤的轉(zhuǎn)錄失調(diào);下調(diào)的相關(guān)通路3條,主要涉及ABC轉(zhuǎn)運體,溶酶體,吞噬小體。3根據(jù)基因和表達譜的GO分析在免疫相關(guān)功能上取交集可知:與益氣活血解毒方療效相關(guān)的可能的免疫方面的生物功能是免疫系統(tǒng)的應(yīng)答,具體的GO號是GO:0006955,基因分型富集到該term上的基因有18個,具體為:FYB,RGS1,SUSD2,FCGRT,IL18RAP,CR2,IFI44L,CD96,C8A,CDIC,CXCR5,IL16,SEMA4D,PDCD1LG2,HLA-DMA,MICA,PKHD1L1,HLA-DPA1,表達譜富集到該 term 上的基因有 CEACAM8,DEFA1,DEFA1,THBS1,CD24。4可能的中藥干預(yù)療效差異的標(biāo)志基因:CD40、AFF3、EIF2AK3、WNK1、FYB、FBXL13、PLXNC1、BCL11A、IFI16、GNG7。5益氣活血解毒方能夠改善氣虛血瘀型晚期卵巢癌患者的免疫功能,產(chǎn)生差異療效。6益氣活血解毒方可以通過對基因以及相關(guān)通路的調(diào)節(jié)調(diào)控Tregs細胞,但與SNPs未見明顯相關(guān)性,可能與DNA去甲基化或miRNA有關(guān)。結(jié)論:1與益氣活血解毒方療效相關(guān)的SNPs位點有1773個,這些位點可能是對中藥敏感的SNPs位點。2益氣活血解毒方療效的差異標(biāo)志基因可能為:CD40、AFF3、EIF2AK3、WNK1、FYB、FBXL13、PLXNC1、BCL11A、IFI16、GNG7。3益氣活血解毒方可能通過改善氣虛血瘀型晚期卵巢癌患者的免疫功能,產(chǎn)生差異療效。4益氣活血解毒方可能通過對基因以及相關(guān)通路的調(diào)節(jié)調(diào)控Tregs細胞治療氣虛血瘀型晚期卵巢癌,但與SNPs位點未見明顯相關(guān)性,可能與DNA去甲基化或miRNA有關(guān)。
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【學(xué)位授予單位】：中國中醫(yī)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R273

【參考文獻】

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