本文關(guān)鍵詞：基于信號放大技術(shù)的表面等離子共振在生化分析中的應(yīng)用

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【摘要】：本論文采用表面等離子共振技術(shù),基于適體與靶分子的特異性識別特性,結(jié)合聚合酶,剪切酶等工具酶的循環(huán)放大作用及納米金生物條碼技術(shù),構(gòu)建了一系列的放大反應(yīng),建立了高靈敏度、高選擇性檢測溶菌酶,DNA,腫瘤細(xì)胞等腫瘤標(biāo)志物的分析新方法,本論文的研究內(nèi)容如下：1、基于靶分子聚合置換循環(huán)放大方法,將生物條碼放大技術(shù)及DNA功能化的量子點(diǎn)放大技術(shù)相結(jié)合,設(shè)計(jì)了一種簡單、高效利用表面等離子共振技術(shù)檢測溶菌酶的新方法。溶菌酶作為靶蛋白質(zhì),可以與金片上的適體DNA特異性結(jié)合,打開的頸環(huán)探針與納米金生物條碼結(jié)合,將其捕獲在金基底上,在聚合酶的作用下,溶菌酶被釋放到溶液中,打開其它的頸環(huán)探針,實(shí)現(xiàn)靶蛋白質(zhì)的源頭循環(huán)放大,DNA功能化的量子點(diǎn)在流經(jīng)反應(yīng)池中與基底上的生物條碼上的探針結(jié)合,通過金基底上結(jié)合質(zhì)量的改變,達(dá)到檢測溶菌酶的目的,實(shí)驗(yàn)中溶菌酶的檢測限為1.68x10-12M,該方法新穎,簡便,實(shí)現(xiàn)了靶蛋白質(zhì)的高選擇性檢測。2、構(gòu)建了基于滾環(huán)復(fù)制放大表面等離子共振檢測靶DNA的新方法,將納米金生物條碼與滾環(huán)復(fù)制相結(jié)合,靶DNA通過堿基互補(bǔ)配對,將基底上的頸環(huán)DNA打開,鎖扣DNA與打開的頸環(huán)DNA末端互補(bǔ)雜交,并在T4連接酶的作用下連接成環(huán),向體系中加入Phi29聚合酶,實(shí)現(xiàn)滾環(huán)復(fù)制放大,形成的滾環(huán)長鏈產(chǎn)物中含有大量的相同序列片段,納米金生物條碼探針作為信號增強(qiáng)元素,通過互補(bǔ)雜交,將金納米粒子捕獲到檢測基底上,增強(qiáng)SPR信號響應(yīng),實(shí)驗(yàn)中靶DNA檢測限可達(dá)0.35 pM,該方法實(shí)現(xiàn)了靶DNA的快速,高靈敏度檢測,在DNA等寡核苷酸的檢測中有很大應(yīng)用空間。3、提出了一種基于靶向激活多級循環(huán)放大表面等離子共振檢測靶DNA及腫瘤細(xì)胞的新方法。信號放大體系包括等溫指數(shù)循環(huán)放大、滾環(huán)復(fù)制放大及納米金信號增強(qiáng)。利用聚合酶和剪切酶的協(xié)同作用,實(shí)現(xiàn)DNA的等溫指數(shù)循環(huán)放大,并以磁性納米粒子作為“中間體”發(fā)生滾環(huán)復(fù)制反應(yīng),磁性納米探針作為載體能夠增大滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)物的負(fù)載量,利用金納米粒子作為信號放大探針,實(shí)現(xiàn)了DNA及腫瘤細(xì)胞的高靈敏、高選擇性檢測,通過多級信號放大對靶DNA及Ramos細(xì)胞的檢測限分別為9.3 aM和10個(gè)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)中反應(yīng)條件溫和,無毒,經(jīng)濟(jì),重現(xiàn)性好,為腫瘤細(xì)胞的檢測提供了一種新型的定性及定量檢測方法,在臨床診斷及生物研究中具有廣闊前景。
【關(guān)鍵詞】：表面等離子共振 循環(huán)放大 納米金生物條碼 適體
【學(xué)位授予單位】：青島科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R730.4;O652
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 第一章 緒論10-28
• 1.1 表面等離子共振技術(shù)10-17
• 1.1.1 表面等離子共振技術(shù)的原理10-12
• 1.1.2 表面等離子共振技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)12
• 1.1.3 表面等離子共振技術(shù)的應(yīng)用12-17
• 1.1.3.1 表面等離子共振檢測蛋白質(zhì)12-14
• 1.1.3.2 表面等離子共振檢測寡核苷酸14-15
• 1.1.3.3 表面等離子共振檢測細(xì)菌和其他分子15-17
• 1.2 納米金17-22
• 1.2.1 納米金放大技術(shù)17-18
• 1.2.2 納米金放大技術(shù)在生化分析中的應(yīng)用18-22
• 1.2.2.1 納米金放大技術(shù)在表面等離子共振檢測中的應(yīng)用18-19
• 1.2.2.2 納米金放大技術(shù)在表面增強(qiáng)拉曼光譜中的應(yīng)用19-21
• 1.2.2.3 納米金放大技術(shù)在電化學(xué)中的應(yīng)用21-22
• 1.3 DNA循環(huán)放大技術(shù)及其在生化分析中的應(yīng)用22-28
• 1.3.1 滾環(huán)復(fù)制放大22-24
• 1.3.2 HCR反應(yīng)24-25
• 1.3.3 剪切酶循環(huán)放大25-28
• 第二章 基于靶分子聚合置換SPR檢測溶菌酶的研究28-43
• 2.1 實(shí)驗(yàn)部分28-32
• 2.1.1 試劑28-29
• 2.1.2 儀器29
• 2.1.3 CdTe量子點(diǎn)的制備及DNA的修飾29-30
• 2.1.4 納米金與生物條碼的制備30-31
• 2.1.5 基底的修飾31
• 2.1.6 靶分子置換聚合酶循環(huán)放大31
• 2.1.7 SPR在線檢測31-32
• 2.2 結(jié)果與討論32-41
• 2.2.1 基于靶分子聚合置換SPR檢測溶菌酶的實(shí)驗(yàn)原理32-33
• 2.2.2 金納米粒子表征33
• 2.2.3 紫外-可見吸收光譜33-34
• 2.2.4 可行性分析34-35
• 2.2.5 條件優(yōu)化35-39
• 2.2.5.1 緩沖溶液pH值的優(yōu)化35
• 2.2.5.2 反應(yīng)溫度的優(yōu)化35-36
• 2.2.5.3 捕獲探針濃度的優(yōu)化36-37
• 2.2.5.4 納米金生物條碼探針比例的優(yōu)化37-38
• 2.2.5.5 循環(huán)反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化38-39
• 2.2.5.6 酶的用量優(yōu)化39
• 2.2.6 溶菌酶SPR檢測靈敏度的研究39-40
• 2.2.7 溶菌酶檢測的選擇性研究40-41
• 2.3 小結(jié)41-43
• 第三章 基于滾環(huán)復(fù)制放大技術(shù)SPR檢測DNA的研究43-52
• 3.1 實(shí)驗(yàn)部分43-45
• 3.1.1 主要試劑43-44
• 3.1.2 納米金及生物條碼的制備44
• 3.1.3 金基底的修飾44-45
• 3.1.4 循環(huán)反應(yīng)放大45
• 3.1.5 SPR在線監(jiān)測45
• 3.2 結(jié)果與討論45-51
• 3.2.1 基于滾環(huán)復(fù)制放大技術(shù)SPR檢測DNA的實(shí)驗(yàn)原理45-46
• 3.2.2 金納米粒子的表征46-47
• 3.2.3 紫外-可見吸收光譜47
• 3.2.4 DNA檢測的靈敏度研究47-50
• 3.2.4.1 納米金增強(qiáng)SPR檢測DNA47-49
• 3.2.4.2 滾環(huán)復(fù)制放大SPR檢測DNA49-50
• 3.2.5 DNA檢測選擇性50-51
• 3.3 小結(jié)51-52
• 第四章 基于靶向激活多級循環(huán)放大表面等離子共振檢測靶DNA及腫瘤細(xì)胞的研究52-68
• 4.1 實(shí)驗(yàn)部分儀器與試劑53-55
• 4.1.1 主要試劑53-54
• 4.1.2 納米金與生物條碼的制備54
• 4.1.3 磁珠上適體DNA的修飾54
• 4.1.4 金基底的修飾54
• 4.1.5 Ramos細(xì)胞的培養(yǎng)54-55
• 4.1.6 循環(huán)反應(yīng)放大55
• 4.1.7 SPR在線監(jiān)測55
• 4.2 結(jié)果與討論55-67
• 4.2.1 基于靶向激活多級循環(huán)放大SPR檢測靶DNA工作原理55-57
• 4.2.2 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化57-62
• 4.2.2.1 反應(yīng)體系中溫度的優(yōu)化57-58
• 4.2.2.2 磁珠上修飾的不同DNA濃度的比例的優(yōu)化58-59
• 4.2.2.3 納米金粒子粒徑的優(yōu)化59
• 4.2.2.4 緩沖溶液pH值的優(yōu)化59-60
• 4.2.2.5 反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化60-61
• 4.2.2.6 金基底上的捕獲DNA濃度的優(yōu)化61-62
• 4.2.3 DNA的靈敏度62-63
• 4.2.4 DNA的選擇性63-64
• 4.2.5 基于靶向激活多級循環(huán)放大SPR檢測Ramos細(xì)胞64-66
• 4.2.6 Ramos細(xì)胞的選擇性66-67
• 4.3 小結(jié)67-68
• 結(jié)論68-70
• 參考文獻(xiàn)70-77
• 致謝77-78
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄78-79

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1 李，

本文編號：987510