本文關(guān)鍵詞：miR-27a介導(dǎo)二甲雙胍抑制人乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖作用的機(jī)制研究

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【摘要】：目的:近年來,乳腺癌的發(fā)病率正以驚人速度上升,已經(jīng)逐漸成為人類最常見的惡性腫瘤之一。大量的研究證實(shí),糖尿病能夠增加乳腺癌的患病風(fēng)險(xiǎn),且與預(yù)后相關(guān),臨床上兩種疾病常同時(shí)存在。二甲雙胍作為指南中一線降糖藥物,已廣泛用于2型糖尿病患者。近年來,大量的流行病學(xué)資料顯示,二甲雙胍可以降低乳腺癌的發(fā)病率,并有助于提高乳腺癌患者的預(yù)后。micro RNAs(mi RNAs)是近年來揭示出的一組非編碼的小分子單鏈RNA,長(zhǎng)度約為19-25個(gè)核苷酸,通過在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控其靶基因的表達(dá)和/或抑制靶蛋白的翻譯來實(shí)現(xiàn)其生理作用。研究證實(shí),mi RNAs與腫瘤密切相關(guān),在腫瘤發(fā)生以及發(fā)展過程中扮演著十分關(guān)鍵的角色。研究證實(shí),micro RNA27a(mi R-27a)有原癌基因活性,在乳腺癌,胃癌,結(jié)腸癌,子宮內(nèi)膜癌等多種腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)狀態(tài)。mi R-27a參與乳腺癌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的調(diào)控等。近年來,國(guó)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),在乳腺癌組織及乳腺癌細(xì)胞MCF-7中,AMPKα2因子表達(dá)受到廣泛抑制,AMPKα2具有腫瘤抑制因子的作用。而至于AMPKα2 m RNA表達(dá)下調(diào)的機(jī)制尚不清楚,因此本研究嘗試從micro RNA與其靶基因之間的作用關(guān)系解釋此現(xiàn)象,初步預(yù)測(cè)AMPKα2可能是mi R-27a的下游靶基因,進(jìn)而從mi RNAs水平探討二甲雙胍治療乳腺癌的新型作用機(jī)制。方法:1.以不同濃度(1mmol/L,2mmol/L,5mmol/L,10 mmol/L,20 mmol/L)的二甲雙胍分別干預(yù)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7,作用48小時(shí)后,用MTT法檢測(cè)不同濃度組MCF-7細(xì)胞的OD值,計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。2.以20mmol/L的二甲雙胍分別干預(yù)MCF-7細(xì)胞不同的時(shí)間(12h,24h,36h,48h,72h),用MTT法檢測(cè)不同時(shí)間組MCF-7細(xì)胞的OD值,計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。3.將細(xì)胞分為對(duì)照組和干預(yù)組,干預(yù)組以20mmol/L的二甲雙胍干預(yù)MCF-7細(xì)胞48小時(shí),用熒光定量PCR方法檢測(cè)mi R-27a及AMPKα2m RNA表達(dá)水平,Western Blotting方法檢測(cè)AMPKα2及凋亡因子caspase-3蛋白表達(dá)水平。4.將細(xì)胞分為6組:對(duì)照組,脂質(zhì)體lipo2000組(lipo2000組),轉(zhuǎn)染mi R-27a mimics組(mi R-27a mimics組),轉(zhuǎn)染mi R-27a inhibitor組(inhibitor組)及轉(zhuǎn)染其各自陰性對(duì)照組(mi R-27a N.C組、inhibitor N.C組)。轉(zhuǎn)染后作用48小時(shí),用熒光定量方法檢測(cè)mi R-27a及AMPKα2 m RNA表達(dá)水平,Western Blotting方法檢測(cè)AMPKα2及caspase-3蛋白表達(dá)水平。MTT法檢測(cè)每組細(xì)胞的OD值,根據(jù)平均值計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。結(jié)果:1.測(cè)得不同濃度組的平均OD值表明,隨著二甲雙胍濃度的增高,各組平均OD值呈下降趨勢(shì)。單因素方差分析結(jié)果顯示,不同濃度二甲雙胍作用后,各組平均OD值之間相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。2.20mmol/L二甲雙胍干預(yù)MCF-7細(xì)胞,隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞生長(zhǎng)明顯被抑制。單因素方差分析結(jié)果顯示,二甲雙胍作用36小時(shí),48小時(shí),72小時(shí)后,均較作用12小時(shí)組出現(xiàn)明顯差異(P0.05)。3.20mmo/L的二甲雙胍干預(yù)48小時(shí)后,熒光定量PCR結(jié)果顯示mi R-27a表達(dá)明顯下調(diào),而AMPKα2 m RNA表達(dá)量較對(duì)照組明顯增加,有顯著性差異(P0.05)。Western Blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,AMPKα2蛋白水平在干預(yù)組表達(dá)增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。同時(shí),干預(yù)組cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組明顯增高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。4.轉(zhuǎn)染mi R-27a mimics組,其mi R-27a表達(dá)顯著增高;轉(zhuǎn)染inhibitor組,其mi R-27a表達(dá)明顯受到抑制,而lipo2000組、mi R-27a N.C組和inhibitor N.C組均未引起mi R-27a表達(dá)水平的變化(P0.05)。5.mi R-27a mimics組AMPKα2 m RNA表達(dá)水平明顯下降(P0.05),且具有濃度依賴性;inhibitor組AMPKα2 m RNA表達(dá)水平則呈濃度依賴性提高(P0.05),lipo2000組、mi R-27a N.C組和inhibitor N.C組均未引起明顯的AMPK m RNA表達(dá)水平的變化(P0.05)。Western Blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí),mi R-27a mimics組AMPKα2蛋白水平表達(dá)降低,而inhibitor組則表達(dá)水平升高,兩者的變化都較對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。6.Western Blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,mi R-27a mimics組caspase-3蛋白水平表達(dá)降低,而inhibitor組caspase-3蛋白表達(dá)水平升高,且兩組之間的變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。7.MTT結(jié)果表明,mi R-27a mimics組OD值平均水平明顯高于其他五組,細(xì)胞增殖抑制率明顯下降;而inhibitor組其OD值平均水平最低,細(xì)胞增殖抑制率最高,且兩組之間的變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論:1.二甲雙胍能夠抑制MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng),且呈濃度依賴和時(shí)間依賴。2.二甲雙胍可能通過下調(diào)mi R-27a的水平,進(jìn)而上調(diào)AMPKα2表達(dá),進(jìn)一步激活caspase-3,最終導(dǎo)致MCF-7細(xì)胞凋亡。3.AMPKα2可能為mi R-27a的下游靶基因。
【關(guān)鍵詞】：二甲雙胍 MCF-7 細(xì)胞凋亡 miR-27a AMPKα2 caspase-3 靶基因
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.9
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-13
• 縮略語/符號(hào)說明13-15
• 前言15-17
• 研究現(xiàn)狀、成果15-16
• 研究目的、方法16-17
• 一、二甲雙胍對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7 作用的實(shí)驗(yàn)研究17-25
• 1.1 對(duì)象和方法17-19
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料17-18
• 1.1.1.1 細(xì)胞系17
• 1.1.1.2 主要試劑17
• 1.1.1.3 主要儀器17-18
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)方法18-19
• 1.1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)方法18-19
• 1.1.2.2 MTT法檢測(cè)二甲雙胍對(duì)MCF-7 細(xì)胞增殖的影響19
• 1.1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法19
• 1.2 結(jié)果19-21
• 1.2.1 二甲雙胍干預(yù)后MCF-7 細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化19-20
• 1.2.2 二甲雙胍抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)具有濃度依賴性20
• 1.2.3 二甲雙胍抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)具有時(shí)間依賴性20-21
• 1.3 討論21-24
• 1.3.1 二甲雙胍對(duì)MCF-7 細(xì)胞的增殖作用的影響21-22
• 1.3.2 二甲雙胍治療乳腺癌的可能機(jī)制22-24
• 1.4 小結(jié)24-25
• 二、mi R-27a及AMPKα2 在二甲雙胍干預(yù)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7 增殖中的作用25-46
• 2.1 對(duì)象和方法25-33
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料25-27
• 2.1.1.1 主要試劑25-26
• 2.1.1.2 主要儀器26
• 2.1.1.3 試劑的配置26-27
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)方法27-33
• 2.1.2.1 二甲雙胍干預(yù)MCF-7 細(xì)胞27
• 2.1.2.2 總RNA提取的步驟27-28
• 2.1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-27a表達(dá)的變化28
• 2.1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)AMPKα2 mRNA表達(dá)的變化28-29
• 2.1.2.5 總蛋白的提取及濃度測(cè)定29-30
• 2.1.2.6 Western Blotting檢測(cè)步驟30-32
• 2.1.2.7 不同的RNA oligo片段轉(zhuǎn)染MCF-7 細(xì)胞32
• 2.1.2.8 MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染不同RNA oligo片段后MCF-7 增殖情況32-33
• 2.1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法33
• 2.2 結(jié)果33-40
• 2.2.1 二甲雙胍可使mi R-27a表達(dá)降低，AMPKα2 在m RNA和蛋白水平表達(dá)升高33-34
• 2.2.2 二甲雙胍可激活caspase-3 分解，使裂解的caspase-3 表達(dá)增多34-35
• 2.2.3 轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)35-36
• 2.2.4 轉(zhuǎn)染miR-27a mimics片段使得AMPKα2 因子表達(dá)降低；轉(zhuǎn)染mi R-27ainhibitor片段，，使AMPKα2 因子表達(dá)上調(diào)36
• 2.2.5 轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照并未引起miR-27a表達(dá)變化，也未引起AMPKα2 表達(dá)的變化36-37
• 2.2.6 各組AMPKα2 在蛋白質(zhì)水平的變化與mRNA變化結(jié)果相一致37-38
• 2.2.7 過表達(dá)miR-27a，caspase-3 表達(dá)減少；沉默miR-27a則caspase-3 表達(dá)高38-39
• 2.2.8 MTT結(jié)果表明，過表達(dá)miR-27a能夠促進(jìn)MCF-7 細(xì)胞的生長(zhǎng)39-40
• 2.3 討論40-45
• 2.3.1 mi RNAs與腫瘤40-41
• 2.3.1.1 miRNAs概述40
• 2.3.1.2 miR-27a與乳腺癌40-41
• 2.3.2 AMPKα2 與腫瘤41-43
• 2.3.2.1 AMPK通路的概述41
• 2.3.2.2AMPKα2 在乳腺癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡中的研究41-43
• 2.3.3 caspase家族與腫瘤43-44
• 2.3.4 P53與腫瘤44-45
• 2.4 小結(jié)45-46
• 結(jié)論46-47
• 參考文獻(xiàn)47-51
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明51-52
• 綜述 miR-27a研究進(jìn)展52-65
• 綜述參考文獻(xiàn)60-65
• 致謝65

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本文編號(hào)：983502