本文關(guān)鍵詞：Notch2在細(xì)胞分裂阻滯后命運(yùn)調(diào)控中的功能研究

  更多相關(guān)文章： 有絲分裂阻滯 阻滯后細(xì)胞命運(yùn) Notch2

【摘要】：目前癌癥已經(jīng)發(fā)展成為嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一,癌癥控制和治療已成為全球性的醫(yī)學(xué)戰(zhàn)略重點(diǎn)。長期以來,針對(duì)腫瘤細(xì)胞無限增殖這一特點(diǎn),紫杉醇(Taxol)、長春堿(vinblastine)等抗有絲分裂藥物被用于腫瘤的臨床治療。紫杉醇等抗有絲分裂化療藥物的使用,會(huì)干擾細(xì)胞內(nèi)微管的正常功能,破壞紡錘體的形成,從而使細(xì)胞發(fā)生有絲分裂阻滯,進(jìn)而引起細(xì)胞的凋亡�？褂薪z分裂藥物即是根據(jù)這一原理殺死腫瘤細(xì)胞從而達(dá)到腫瘤治療的目的。然而近年來的研究結(jié)果顯示,紫杉醇等抗有絲分裂化療藥物引起細(xì)胞發(fā)生有絲分裂阻滯后,除了在分裂期凋亡這一命運(yùn)外,絕大多數(shù)細(xì)胞會(huì)有另外兩種命運(yùn)走向,即不正常分裂形成非整倍體和阻滯后退出有絲分裂而進(jìn)入下一間期。如何提高有絲分裂阻滯后凋亡細(xì)胞的比例,降低阻滯后其他非凋亡命運(yùn)走向的細(xì)胞比例成為亟待解決的問題。關(guān)于細(xì)胞有絲分裂期間的研究,目前大多數(shù)的研究側(cè)重于有絲分裂期間細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的修飾和降解,新合成的蛋白質(zhì)的研究卻很少得到關(guān)注。本研究采用近年來基于高通量測序開發(fā)并逐漸完善的Ribosome Profiling技術(shù),對(duì)正常分裂期和分裂阻滯后的細(xì)胞進(jìn)行全基因組翻譯水平上的測序,整理分析得到一些阻滯后有差異翻譯的基因,并對(duì)一些差異翻譯的重點(diǎn)基因進(jìn)行篩選鑒定。Notch2是阻滯后差異翻譯的基因之一,屬于Notch家族,與細(xì)胞的增殖、凋亡及個(gè)體的發(fā)育都有密切的關(guān)系。本研究重點(diǎn)對(duì)Notch2在有絲分裂阻滯細(xì)胞命運(yùn)決定中的功能以及Taxol阻滯后Notch2上游活化配體等展開了研究。研究結(jié)果顯示,與正常分裂期相比,Taxol阻滯后Notch2在蛋白水平上發(fā)生了明顯上調(diào),Notch2在分裂阻滯期的蛋白質(zhì)合成增加,驗(yàn)證了本研究測序結(jié)果的正確性和可靠性。對(duì)Notch2進(jìn)行敲低后,活細(xì)胞和免疫熒光結(jié)果顯示Notch2的敲低對(duì)細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程并沒有影響。發(fā)生分裂阻滯后,與正常細(xì)胞相比Notch2敲低的細(xì)胞在下一個(gè)間期死亡的概率明顯增加。這個(gè)結(jié)果暗示著Notch2可能在下個(gè)G1期細(xì)胞的存活過程中發(fā)揮作用。細(xì)胞周期各時(shí)期Notch2蛋白水平檢測結(jié)果顯示,在分裂期和分裂阻滯期細(xì)胞中切割活化的Notch2發(fā)生了修飾后降解。另外,Notch2下游分子Hes1 mRNA水平在分裂期和分裂阻滯期細(xì)胞中明顯低于G1、S期,Notch2在分裂期和分裂阻滯期對(duì)下游分子的轉(zhuǎn)錄活性很低。分裂阻滯后Notch2主要是在不正常分裂后下一個(gè)G1期發(fā)揮作用而并非在分裂阻滯期發(fā)揮作用。Notch2的敲低會(huì)使Hela細(xì)胞中周期蛋白cyclinD1 mRNA水平明顯降低,分裂阻滯后敲低Notch2可能會(huì)通過抑制cyclinD1的表達(dá),使細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯,進(jìn)而加劇不正常分裂后細(xì)胞在下一個(gè)G1期的死亡。敲低Notch2會(huì)抑制Taxol阻滯后周期蛋白p27Kipl mRNA水平的升高,可能會(huì)影響Taxol阻滯后細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯的概率。對(duì)于抗凋亡分子Mcl-1和Bcl2, Notch2的敲低會(huì)抑制Taxol阻滯后Mcl-1、Bcl2 mRNA水平的升高,進(jìn)而可能促進(jìn)不正常分裂后下一個(gè)G1期細(xì)胞的死亡。最后,本研究中對(duì)Taxol阻滯后Notch2可能的活化配體進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)Hela細(xì)胞中Taxol阻滯后Notch2可能的活化配體為JAG1,并對(duì)JAG1 shRNA進(jìn)行了篩選,可用于后續(xù)JAG1敲低的功能實(shí)驗(yàn)。
【關(guān)鍵詞】：有絲分裂阻滯 阻滯后細(xì)胞命運(yùn) Notch2
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R730.53
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第一章 緒論12-34
• 1.1. 腫瘤概述12-21
• 1.1.1. 維持增殖信號(hào)12-13
• 1.1.2. 生長抑制因子的缺失13-14
• 1.1.3. 抗凋亡特性14-15
• 1.1.4. 無限復(fù)制能力15-16
• 1.1.5. 誘導(dǎo)血管發(fā)生16
• 1.1.6. 腫瘤遷移和浸潤16-17
• 1.1.7. 腫瘤細(xì)胞中基因突變多發(fā)以及基因組的不穩(wěn)定性17-18
• 1.1.8. 腫瘤細(xì)胞的代謝重編程18-19
• 1.1.9. 腫瘤的免疫逃逸19-20
• 1.1.10. 腫瘤和炎癥反應(yīng)20-21
• 1.2. 腫瘤治療概述21-22
• 1.3. 抗有絲分裂類藥物用于腫瘤治療研究22-25
• 1.3.1. 抗有絲分裂化療藥物概述22-23
• 1.3.2. 紡錘體檢查點(diǎn)和有絲分裂阻滯23-24
• 1.3.3. 抗有絲分裂類化療藥物臨床應(yīng)用現(xiàn)狀24-25
• 1.4. 有絲分裂阻滯后細(xì)胞命運(yùn)研究25-29
• 1.4.1. 概述25-26
• 1.4.2. 分裂期死亡(mitotic cell death)26-27
• 1.4.3. Slippage27
• 1.4.4. 不正常分裂(Abnormal mitosis)27-28
• 1.4.5. 分裂阻滯后細(xì)胞不同命運(yùn)走向解釋模型28
• 1.4.6. 尚待解決的問題28-29
• 1.5. Ribosome profiling29-30
• 1.6. Notch2概述30-34
• 1.6.1. Notch信號(hào)通路30-31
• 1.6.2. Notch2與腫瘤研究現(xiàn)狀31-32
• 1.6.3. Notch2與細(xì)胞周期32
• 1.6.4. Notch2與細(xì)胞凋亡32-34
• 第二章 實(shí)驗(yàn)材料與方法34-48
• 2.1. 實(shí)驗(yàn)材料34-35
• 2.1.1. 實(shí)驗(yàn)試劑34-35
• 2.1.2. 實(shí)驗(yàn)器材35
• 2.2. 實(shí)驗(yàn)方法35-48
• 2.2.1. Hela細(xì)胞的培養(yǎng)35-36
• 2.2.2. 不同時(shí)期Hela細(xì)胞的收獲36-37
• 2.2.3. 細(xì)胞total RNA抽提37
• 2.2.4. 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)37-38
• 2.2.5. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR38-40
• 2.2.6. 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)40-43
• 2.2.7. 慢病毒包裝和感染43-44
• 2.2.8. 穩(wěn)定細(xì)胞株篩選44-45
• 2.2.9. 免疫熒光(Immunofluorescence)45-46
• 2.2.10. 活細(xì)胞拍攝46-48
• 第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析48-62
• 3.1. 不同時(shí)期Hela細(xì)胞的收獲48
• 3.2. Ribosome profiling差異翻譯基因48-49
• 3.3. Taxol阻滯后Notch2蛋白水平檢測49-50
• 3.4. Notch2穩(wěn)定細(xì)胞株敲低效果檢測50-51
• 3.5. Notch2敲低對(duì)細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程影響研究51-53
• 3.6. Notch2敲低對(duì)Taxol阻滯后細(xì)胞命運(yùn)影響研究53-55
• 3.7. 各時(shí)期Notch2蛋白水平檢測55-57
• 3.8. 細(xì)胞周期相關(guān)分子p27Kip1,CyclinD1 mRNA水平檢測57-58
• 3.9. 凋亡相關(guān)分子Mcl-1和Bcl-2 mRNA水平檢測58-59
• 3.10. Hela細(xì)胞中阻滯后Notch2配體檢測59-62
• 第四章 總結(jié)與討論62-66
• 參考文獻(xiàn)66-72
• 致謝72

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：977330