本文關(guān)鍵詞：探討PTEN作為肝內(nèi)膽管癌個性化治療靶標(biāo)的研究

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【摘要】：肝內(nèi)膽管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma, ICC)是指左右膽管匯合部以上的膽管上皮起源的惡性腫瘤。在臨床中表現(xiàn)為潛伏期長,惡性程度高,放化療抵抗,預(yù)后差等。同時,肝內(nèi)膽管癌在病因和發(fā)病機(jī)制上研究不是很深入,缺乏明確的分子指標(biāo)1。流行病學(xué)資料顯示近三十年來肝內(nèi)膽管癌的發(fā)病率持續(xù)上升；與此同時,隨著研究的深入,人們對參與ICC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制也有了更進(jìn)一步的認(rèn)識。外顯子測序顯示P53, KRAS, SMAD4, IHD等是在肝內(nèi)擔(dān)管癌中常常突變或激活的基因,對其惡性進(jìn)程影響重大。PTEN,全稱是磷酸酶與張力蛋白同源蛋白。1997年被兩個獨(dú)立的課題組發(fā)現(xiàn)和確認(rèn),是繼P53之后發(fā)現(xiàn)的最重要的抑癌基因2,。在多種腫瘤中,磷酸晦與張力蛋白同源蛋白PTEN功能的重要性是因為其缺失,下調(diào)或突變而顯現(xiàn)出來的。PTEN通過自身脂質(zhì)磷酸酶活性,拮抗PI3K-Akt-mTOR信號通路,調(diào)控細(xì)胞多種生理進(jìn)程,包括：存活,增殖,能量代謝,細(xì)胞骨架構(gòu)建以及細(xì)胞習(xí)相互識別。因此,調(diào)節(jié)PTEN表達(dá)和功能的機(jī)制,在腫瘤發(fā)生發(fā)展中尤其重要4。值得注意的是,隨著對PTEN功能認(rèn)識的深入,越來越多的研究發(fā)現(xiàn)腫瘤中PTEN缺失與否直接關(guān)系著對放化療藥物和抑制劑的敏感性,有文章指出PTEN的缺失會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞基因組不穩(wěn)定,這種不穩(wěn)定性恰好適用于某些藥物,從而可以實現(xiàn)以PTEN為基礎(chǔ)的個性化治療。我們的工作正是得到上述研究的啟發(fā),開展了PTEN在肝內(nèi)膽管癌中的功能探索。首先我們通過cDNA測序法檢測肝內(nèi)膽管癌組織,發(fā)現(xiàn)PTEN有突變,盡管這隨后被證明為PTEN的假基因(PTENp1),但也側(cè)面反應(yīng)了PTEN真基因的缺失；對PTEN的外顯子進(jìn)行PCR測序發(fā)現(xiàn),ICC細(xì)胞系HCCC-9810有外顯子的缺失,導(dǎo)致全長PTEN的mRNA不能被轉(zhuǎn)錄出來。同時我們通過Western Blot和免疫組化的方法發(fā)現(xiàn)PTEN的確在肝內(nèi)膽管癌組織和細(xì)胞系中存在缺失；結(jié)合臨床資料,我們發(fā)現(xiàn)PTEN的表達(dá)量與ICC患者的預(yù)后相關(guān),高表達(dá)PTEN組的患者預(yù)后更好。更有意義的是,PTEN的缺失導(dǎo)致它們對于回補(bǔ)PTEN反應(yīng)性不同：PTEN野生型的ICC細(xì)胞發(fā)生抵抗,PTEN突變?nèi)笔凸芳?xì)胞出現(xiàn)死亡：這在基于病人來源的腫瘤異種移植PDX模型中得到很好的驗。同時,PTEN缺失的ICC腫瘤對化療藥物吉西他濱(GEM)和小分子抑制劑Bortezomib和Rapamycin更為敏感。實驗方法：1、對肝內(nèi)膽管癌組織和細(xì)胞系進(jìn)行cDNA和基因組外顯子PCR擴(kuò)增后測序,檢測是否存在突變；2、用蛋白免疫印跡法和免疫組化檢測肝內(nèi)膽管癌組織和細(xì)胞系中PTEN表達(dá)情況；3、統(tǒng)計和分析127例ICC腫瘤組織的石蠟切片PTEN免疫組化結(jié)果：4、檢測肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞系HCCC-9810和RBE增殖遷移能力；觀察兩種細(xì)胞對恢復(fù)PTEN表達(dá)的反應(yīng)；用流式細(xì)胞技術(shù)檢測處理后的細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡；加入Akt抑制劑LY294002,凋亡抑制劑z-VAD,壞死抑制劑Necrostatin1后檢測細(xì)胞變化情況。5、基因芯片分析兩種細(xì)胞系PTEN過表達(dá)后的基因變化；用Western Blotting檢測PTEN過表達(dá)影響的信號通路；6、在ICC腫瘤細(xì)胞系RBE和HCCC-9810中過表達(dá)PTEN,檢測細(xì)胞內(nèi)泛素化水平；在HEK-293T細(xì)胞中共轉(zhuǎn)HA標(biāo)簽的泛素和PTEN的質(zhì)粒,檢測細(xì)胞內(nèi)泛素化水平。7、用溶酶體探針Lysotracker和外轉(zhuǎn)GFP-LC3質(zhì)粒檢測RBE和HCCC-9810細(xì)胞過表達(dá)PTEN的自噬-溶酶體變化情況；8、在RBE和HCCC-9810細(xì)胞系中加入蛋白酶體抑制劑MG132和自噬激活劑Rapamycin,檢測細(xì)胞存活情況;9、在RBE和HCCC-9810細(xì)胞中過表達(dá)PTEN后,加入不同信號通路的抑制劑,檢測細(xì)胞的存活情況。10、在人源腫瘤異種移植PDX模型中,瘤內(nèi)注射PTEN腺病毒,檢測PTEN對于ICC腫瘤的治療作用；另外,在該動物模型中腹腔注射吉西他濱(GEM),檢測不同PTEN背景ICC腫瘤的反應(yīng)性。實驗結(jié)果：1、PTEN在ICC腫瘤組織和細(xì)胞系中存在突變；2、PTEN表達(dá)量在部分ICC腫瘤組織和細(xì)胞系中發(fā)生缺失和下調(diào)：在ICC細(xì)胞系中,RBE為PTEN野生型,HCCC-9810為PTEN缺失型；3、PTEN的表達(dá)和ICC患者預(yù)后存活相關(guān),PTEN表達(dá)高組的患者中位無富存活時間和中位總體存活時間更長；4、RBE和HCC-9810細(xì)胞系在增殖遷移等基本生命過程中差別不大;但是當(dāng)回補(bǔ)PTEN后,HCCC-9810出現(xiàn)死亡,且不完全依賴于PI3K-Akt信號通路的抑制；RBE細(xì)胞對于PTEN回補(bǔ)反應(yīng)性不大。5、基因芯片顯示HCCC-9810細(xì)胞PTEN過表達(dá)后細(xì)胞周期和DNA復(fù)制受到抑制,同RBE相比,HCCC-9810細(xì)胞中溶酶體功能上調(diào),泛素—蛋白酶體功能卜調(diào)是比較特異的、可能導(dǎo)致死亡的原因；Western Bloting也顯示同樣的結(jié)果。6. HCCC-9810細(xì)胞過表達(dá)PTEN后,泛素化水平降低;該過程依賴PTEN的酶活性,包括質(zhì)粒磷酸酶和蛋白磷酸酶活性。7、在ICC細(xì)胞系中,PTEN能夠激活溶酶體功能,促進(jìn)細(xì)胞自噬,該過程不完全依賴其酶活性。8、在HCCC-9810細(xì)胞中,同時激活自噬和抑制泛素-蛋白酶體功能,將會導(dǎo)致其死亡,而RBE中無明顯變化。9、CQ(溶酶體抑制劑),Sal (PERK抑制劑,抑制ER stress), Necro (RIP3抑制劑,抑制細(xì)胞壞死),z-VAD (Caspase抑制劑,抑制細(xì)胞凋亡)對PTEN介導(dǎo)的9810細(xì)胞死亡有一定的拮抗作用。10、PDX模型中,PTEN野生型的ICC腫瘤對PTEN腺病毒介導(dǎo)的治療效果不佳,而PTEN缺失型ICC腫瘤則有很好的治療效果；同時,吉西他濱對PTEN缺失的ICC腫瘤治療效果良好。實驗結(jié)論：研究中我們發(fā)現(xiàn),PTEN在肝內(nèi)膽管癌中突變,這種突變將導(dǎo)致蛋白表達(dá)映失；PTEN的表達(dá)影響ICC腫瘤患者的預(yù)后,PTEN高表達(dá)組的患者預(yù)更好；PTEN通過激活溶酶體,促進(jìn)自噬,抑制泛素-蛋白酶體信號通路,引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)立急等生物學(xué)過程導(dǎo)致PTEN缺失型的ICC腫瘤死亡：用小分子抑制劑誘發(fā)上述過程也能治療PTEN缺失型的ICC腫瘤；而PTEN野生型的ICC腫瘤則抵抗上述效應(yīng)。PTEN缺失型的ICC腫瘤對吉西他濱(GEM)更為敏感,PTEN野生型的腫瘤反應(yīng)性差。因此,PTEN可以作為肝內(nèi)膽管癌個性化治療的靶標(biāo),指導(dǎo)臨床用藥(化療藥物、小分子抑制劑等)；同時,回補(bǔ)PTEN也是缺失型ICC中腫瘤良好的治療策略。
【關(guān)鍵詞】：肝內(nèi)膽管癌ICC 磷酸酶與張力蛋白同源蛋白PTEN 人源腫瘤異種移植PDX 個性化治療
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.8
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-9
• 英文縮略詞9-10
• 前言10-12
• 材料和方法12-22
• 實驗結(jié)果22-33
• 討論33-36
• 參考文獻(xiàn)36-38
• 綜述38-51
• 參考文獻(xiàn)45-51
• 在讀期間發(fā)表的文章51-52
• 致謝52-53

【參考文獻(xiàn)】

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 劉麗娟;RMP通過維持線粒體的穩(wěn)態(tài)促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖的初步研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2014年

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本文編號：972096