本文關(guān)鍵詞：在人間充質(zhì)干細(xì)胞及癌細(xì)胞內(nèi)Oct4的表達(dá)及其DNA甲基化的研究

  更多相關(guān)文章： Oct4 間充質(zhì)干細(xì)胞 癌癥 DNA甲基化

【摘要】：目的:研究Oct4在人間充質(zhì)干細(xì)胞和幾種癌細(xì)胞中的表達(dá)及其DNA甲基化對Oct4表達(dá)調(diào)控的作用。方法:1.采用組織塊法和梯度離心法分別分離UC-MSCs和BM-MSCs;2.通過成骨和成脂誘導(dǎo)分化實驗鑒定MSCs的多向分化潛能;3.采用流式細(xì)胞術(shù)鑒定MSCs的表面抗原;4.分別采用實時熒光定量PCR(Real-time PCR)、細(xì)胞免疫熒光(ICC)和流式細(xì)胞術(shù)(FACS)檢測Oct4基因在hIPS、UC-MSCs、BM-MSCs、DU145、PC-3、MCF-7、HeLa、293T細(xì)胞內(nèi)的表達(dá);5.采用甲基化特異性PCR分析Oct4調(diào)控區(qū)域的CpG位點的甲基化狀態(tài)。結(jié)果:1.采用組織塊法和梯度離心分別分離了UC-MSCs和BM-MSCs;2.通過成骨和成脂誘導(dǎo)分化實驗將MSCs誘導(dǎo)分化為成骨和成脂細(xì)胞,確認(rèn)了MSCs具有多向分化潛能;3.采用流式細(xì)胞術(shù)鑒定了MSCs的表面抗原,結(jié)果表明MSCs陽性標(biāo)記基因的表達(dá)水平均超過95%,同時陰性標(biāo)記基因的表達(dá)水平均低于2%,確認(rèn)了分離的MSCs;4.Real-Time PCR表明檢測的細(xì)胞均能表達(dá)Oct4 mRNA;ICC和FACS實驗表明檢測的細(xì)胞均能表達(dá)Oct4蛋白質(zhì);5.甲基化分析發(fā)現(xiàn),在Oct4轉(zhuǎn)錄起始位點上游的三個關(guān)鍵順式調(diào)控區(qū)域內(nèi),hIPS呈現(xiàn)低甲基化,而MSCs呈現(xiàn)中度甲基化,其他所研究的細(xì)胞均處于高度甲基化;而在Oct4轉(zhuǎn)錄起始位點下游的一段DNA區(qū)域內(nèi)(+37~+546),UC-MSCs細(xì)胞處于中度甲基化,而其他細(xì)胞(包括hIPS)均處于較高的甲基化狀態(tài)。結(jié)論:1.分離的MSCs具有多向分化潛能,且能表達(dá)MSCs特異性表面標(biāo)記蛋白;2.Oct4在成體干細(xì)胞和多種人癌細(xì)胞系中均可表達(dá);3.DNA甲基化參與Oct4基因在人MSCs和癌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)調(diào)控,且在UC-MSCs和BM-MSCs內(nèi)DNA甲基化對Oct4基因的調(diào)節(jié)機制可能不同。
【關(guān)鍵詞】：Oct4 間充質(zhì)干細(xì)胞 癌癥 DNA甲基化
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R730.2
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 1 前言9-23
• 1.1 間充質(zhì)干細(xì)胞的概述9-13
• 1.1.1 間充質(zhì)干細(xì)胞的定義9
• 1.1.2 間充質(zhì)干細(xì)胞的特性9-10
• 1.1.3 間充質(zhì)干細(xì)胞的體外多向分化10-11
• 1.1.4 間充質(zhì)干細(xì)胞的微環(huán)境11
• 1.1.5 間充質(zhì)干細(xì)胞在治療中的應(yīng)用11-13
• 1.2 Oct4基因的簡介13-19
• 1.2.1 Oct4基因13-14
• 1.2.2 Oct4基因內(nèi)各種調(diào)控元件參與其表達(dá)調(diào)控14
• 1.2.3 OCT4在體細(xì)胞重編程中的關(guān)鍵作用14-15
• 1.2.4 OCT4的功能受到選擇性剪切和翻譯后修飾的調(diào)控15-16
• 1.2.5 OCT4在間充質(zhì)干細(xì)胞中的作用16-18
• 1.2.6 OCT4在癌癥中的作用18-19
• 1.3 DNA甲基化的概述19-23
• 1.3.1 DNA甲基化的簡介19
• 1.3.2 DNA甲基化的功能及作用機制19-20
• 1.3.3 DNA甲基化的研究方法20-23
• 2 材料與方法23-42
• 2.1 實驗材料23-28
• 2.1.1 實驗儀器23-24
• 2.1.2 主要實驗試劑24-26
• 2.1.3 溶液配制26-28
• 2.2 實驗方法28-42
• 2.2.1 UC-MSCs原代分離28-29
• 2.2.2 BM-MSCs原代分離29-30
• 2.2.3 UC-MSCs傳代培養(yǎng)30-31
• 2.2.4 MSCs凍存31
• 2.2.5 MSCs解凍復(fù)蘇31
• 2.2.6 其他細(xì)胞培養(yǎng)31
• 2.2.7 UC-MSCs成骨分化31-32
• 2.2.8 茜素紅染色32
• 2.2.9 ALP染色32
• 2.2.10 UC-MSCs成脂分化32-33
• 2.2.11 油紅O染色33
• 2.2.12 流式細(xì)胞術(shù)33
• 2.2.13 細(xì)胞總RNA提取33-34
• 2.2.14 DNase I處理總RNA34
• 2.2.15 將處理后的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA34-35
• 2.2.16 Real-Time PCR35-36
• 2.2.17 ICC實驗36
• 2.2.18 基因組DNA提取36-37
• 2.2.19 對提取的基因組 DNA 進行化學(xué)處理37
• 2.2.20 甲基化特異性PCR37-38
• 2.2.21 DNA瓊脂糖凝膠電泳及PCR產(chǎn)物切膠回收38-39
• 2.2.22 DNA克隆及測序39-41
• 2.2.23 統(tǒng)計學(xué)分析41-42
• 3 結(jié)果42-52
• 3.1 UC-MSCs的分離和形態(tài)42-43
• 3.2 BM-MSCs的分離43-44
• 3.3 UC-MSCs的成脂分化44
• 3.4 UC-MSCs的成骨分化44-45
• 3.5 UC-MSCs的流式細(xì)胞術(shù)鑒定45-46
• 3.6 Real-Time PCR檢測Oct4在各種細(xì)胞中的表達(dá)46-47
• 3.7 流式細(xì)胞術(shù)（FACS）檢測Oct4在各種細(xì)胞中的表達(dá)47-48
• 3.8 細(xì)胞免疫熒光（ICC）檢測Oct4在各種細(xì)胞中的表達(dá)48-49
• 3.9 各種細(xì)胞Oct4調(diào)控區(qū)域的DNA甲基化檢測49-52
• 4 討論52-55
• 5 結(jié)論55-56
• 參考文獻(xiàn)56-67
• 在校期間發(fā)表論文情況67-68
• 致謝68

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本文編號：968466