本文關(guān)鍵詞：組織特異性溶瘤腺病毒對膀胱腫瘤干細胞的作用

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【摘要】：目的:每年新發(fā)膀胱腫瘤中,大約70%的是非肌層浸潤性膀胱癌,經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切除術(shù)手術(shù)和膀胱內(nèi)化療藥物灌注是目前最主要的治療方式,但經(jīng)過治療后,5年內(nèi)仍將近一半的膀胱腫瘤發(fā)生復(fù)發(fā)或進展成肌層浸潤性膀胱癌。學者們認為這可能與膀胱腫瘤干細胞有關(guān)。膀胱腫瘤干細胞是存在于膀胱腫瘤中的少數(shù)具有自我更新和增殖分化潛能的細胞,膀胱腫瘤的化療藥物抵抗、復(fù)發(fā)和進展與膀胱腫瘤干細胞的存在密切相關(guān)。該次研究應(yīng)用ALDEFLUOR kit分選試劑盒通過流式細胞儀分選膀胱腫瘤干細胞,并對其進行腫瘤干細胞鑒定;測定膀胱腫瘤干細胞表面CAR和CD46的表達情況;用本實驗室前期已構(gòu)建完成的膀胱組織特異性溶瘤腺病毒感染膀胱腫瘤干細胞,觀察Ad-PSCAE-UPⅡ-E1A-AR(APU-E1A-AR)膀胱腫瘤特異性溶瘤腺病毒對膀胱腫瘤干細胞的殺傷效果。方法:常規(guī)培養(yǎng)膀胱腫瘤細胞株T24和EJ。應(yīng)用ALDEFLUOR kit分選試劑盒通過流式細胞儀分選膀胱腫瘤干細胞;首先,用無血清平板克隆形成實驗觀察膀胱腫瘤干細胞的克隆形成能力,用40uM順鉑干預(yù)膀胱腫瘤細胞,測定存活細胞內(nèi)ALDH的表達情況,繼續(xù)培養(yǎng)分選得到的膀胱腫瘤干細胞一段時間后,測定細胞內(nèi)ALDH的表達情況,觀察膀胱腫瘤干細胞是否有部分發(fā)生分化。綜合膀胱腫瘤干細胞的克隆形成能力、化療藥物抵抗及分化能力對分選所得細胞進行鑒定。其次,提取膀胱腫瘤細胞及膀胱腫瘤干細胞RNA,用RT-PCR法測定膀胱腫瘤干細胞中CAR基因和CD46基因的表達情況,比較兩種細胞內(nèi)CAR與CD46的表達是否有差異;用細胞免疫化學方法檢測膀胱腫瘤干細胞表面CAR和CD46的情況,同時將其表達量與未分選膀胱腫瘤細胞進行對比;用MTT法檢測膀胱組織特異性溶瘤腺病毒殺傷膀胱腫瘤干細胞的最佳病毒滴度和干預(yù)時間,用分選得到的最佳干預(yù)方案對膀胱腫瘤干細胞進行干預(yù),在光學顯微鏡下觀察膀胱組織特異性溶瘤腺病毒對膀胱腫瘤干細胞的干預(yù)效果。結(jié)果:經(jīng)過分選發(fā)現(xiàn),約有15%的膀胱腫瘤細胞內(nèi)是膀胱腫瘤干細胞,與未經(jīng)分選的膀胱腫瘤相比,膀胱腫瘤干細胞的克隆形成能力強,可繼續(xù)分化出ALDH(—)細胞,并具有化療藥物抵抗能力,以上一系列表現(xiàn)均符合腫瘤干細胞的特性。RT—PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn),膀胱腫瘤干細胞表面CAR基因的表達較未分選膀胱腫瘤細胞低,兩種腫瘤細胞內(nèi)的CD46基因表達無明顯差異;細胞組織化學實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),膀胱腫瘤干細胞內(nèi)CAR的表達較未分選腫瘤細胞低,兩者的CD46表達都比較高。通過MTT法發(fā)現(xiàn),病毒MOI值為80,干預(yù)48h后,超過一半的膀胱腫瘤干細胞發(fā)生裂解死亡,說明膀胱組織特異性溶瘤腺病毒Ad-PSCAE-UPⅡ-E1A-AR對膀胱腫瘤干細胞具有一定殺傷作用。結(jié)論:用ALDH作為分子標記物分選得到的ALDH(+)膀胱腫瘤細胞具有化療藥物抵抗、自我更新及繼續(xù)分化等能力,符合腫瘤干細胞的特性,因此ALDH可以作為分選膀胱腫瘤干細胞的分子標志物。同時,用MOI為80的膀胱組織特異性溶瘤腺病毒對膀胱腫瘤干細胞作用48h后出現(xiàn)一定干預(yù)效果。
【關(guān)鍵詞】：膀胱腫瘤干細胞 組織特異性溶瘤腺病毒 柯薩奇病毒受體 ALDH
【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.14
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-9
• 第一章 前言9-17
• 1.1 膀胱腫瘤干細胞研究及治療進展9-15
• 1.2 基因治療15
• 1.3 溶瘤腺病毒可靶向治療膀胱腫瘤干細胞15-16
• 1.4 本實驗研究目的及技術(shù)路線16-17
• 第二章 材料與方法17-23
• 2.1 主要實驗材料與試劑17
• 2.2 主要實驗儀器17-18
• 2.3 細胞培養(yǎng)與處理18
• 2.4 干細胞分選18-19
• 2.5 腫瘤細胞平板克隆形成實驗19-20
• 2.6 大劑量順鉑（CIS）誘導(dǎo)腫瘤干細胞實驗20
• 2.7 MTT法檢測細胞存活率20-21
• 2.8 免疫細胞化學21-22
• 2.9 實時熒光定量PCR（RT—PCR）22-23
• 第三章 結(jié)果23-30
• 3.1 膀胱腫瘤干細胞的分選和鑒定23-24
• 3.2 膀胱腫瘤干細胞分化鑒定24-25
• 3.3 膀胱腫瘤干細胞平板克隆形成實驗25
• 3.4 大劑量順鉑干預(yù)后存活膀胱腫瘤細胞ALDH的表達情況25-26
• 3.5 膀胱腫瘤干細胞CAR和CD46的表達情況26-27
• 3.6 Ad-PSCAE-UPⅡ-E1A-AR溶瘤腺病毒干預(yù)膀胱腫瘤干細胞27-30
• 第四章 討論30-35
• 第五章 結(jié)論35-36
• 第六章 參考文獻36-40
• 第七章 在學期間的研究成果40-41
• 第八章 致謝41-42
• 第九章 中英文縮寫對照42

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