本文關(guān)鍵詞：具有轉(zhuǎn)移潛能的人肺腺癌細胞系M-LAC的建立及其腫瘤干細胞和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化生物學(xué)特性的初步研究

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【摘要】：背景：肺癌是最常見的惡性腫瘤之一,在男性和女性中均為腫瘤死亡的首要原因。肺腺癌是最常見的一種非小細胞肺癌,通常起始于肺偏外部的組織,可能在出現(xiàn)癥狀和被診斷以前就已存在很長時間。關(guān)于肺癌發(fā)病和轉(zhuǎn)移的機制至今尚不明確,臨床對此缺乏有效的治療方法,因此,研究肺癌發(fā)病和轉(zhuǎn)移的機制并探索有效的診療方法是亟待解決的課題。肺癌轉(zhuǎn)移的研究途徑分為體內(nèi)和體外兩種,體內(nèi)途徑多是通過動物體內(nèi)的篩選來建立肺癌轉(zhuǎn)移的實驗?zāi)Ｐ?體外途徑則主要是通過建立類似人工基質(zhì)膜的生物膜系統(tǒng)來模擬轉(zhuǎn)移的過程。二者均存在一定的局限性,這在很大程度上滯后了肺癌轉(zhuǎn)移診療研究的進展。迄今常用的肺腺癌細胞系如A549、SPC-A1等多取材于臨床手術(shù)切除的標(biāo)本,其分期較早,對于肺癌轉(zhuǎn)移的研究具有一定的局限性。肺腺癌轉(zhuǎn)移的細胞模型多是通過有限稀釋法分離出亞克隆細胞株,再經(jīng)動物體內(nèi)的篩選,建立轉(zhuǎn)移力高的細胞亞株。然而在體外培養(yǎng)時隨著生長環(huán)境的不同,細胞特性也在不斷變化,也可能發(fā)生如基因突變、基因異位或缺失等變化,其結(jié)果可能導(dǎo)致細胞產(chǎn)生生物學(xué)性狀上的變化,這對于研究腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生發(fā)展的內(nèi)在機制是不利的。惡性胸腹水的出現(xiàn)表明癌癥已有浸潤或轉(zhuǎn)移。以晚期肺腺癌患者的胸水或腹水為瘤源培養(yǎng)建立具有轉(zhuǎn)移潛能的人肺腺癌細胞系,將減少因體外實驗因素造成的對肺癌細胞內(nèi)在生物學(xué)行為的影響,將為研究肺癌轉(zhuǎn)移的機制和識別腫瘤治療靶點提供良好的細胞模型。腫瘤干細胞(cancer stem cells, CSCs)學(xué)說為肺癌轉(zhuǎn)移的治療提供了全新的研究方向,成為了研究的熱點趨勢。從腫瘤干細胞理論的角度來探索腫瘤轉(zhuǎn)移的生物學(xué)機制,可為進一步尋找治療肺癌轉(zhuǎn)移的靶點提供理論依據(jù)。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變(epithelia-mesenchymal transition, EMT)是指細胞由上皮表型向間質(zhì)表型的轉(zhuǎn)變,這種轉(zhuǎn)變是引起腫瘤遠處轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟。因此探索所建立的具有轉(zhuǎn)移潛能的人肺腺癌細胞系是否存在EMT現(xiàn)象,將為進一步揭示人肺腺癌轉(zhuǎn)移發(fā)生的本質(zhì)提供新的視角,同時也為人肺腺癌治療的分子基礎(chǔ)研究提供新的思路。目的：1.以人肺腺癌患者惡性腹水為瘤源,經(jīng)原代培養(yǎng)、傳代,建立具有轉(zhuǎn)移潛能的人肺腺癌細胞系M-LAC (Metastastic Lung Adenoarcinoma);2.研究具有轉(zhuǎn)移潛能的人肺腺癌細胞系M-LAC的基本生物學(xué)特性；3.初步研究具有轉(zhuǎn)移潛能的人肺腺癌細胞系M-LAC是否具有腫瘤干細胞和上皮=間質(zhì)轉(zhuǎn)化的生物學(xué)特性。方法：1.具有轉(zhuǎn)移潛能的肺腺癌細胞系M-LAC (Metastastic Lung Adenoarcinoma)韻建立：離心分離法從人肺腺癌患者惡性腹水中分離獲得肺腺癌細胞,優(yōu)化最適合細胞生長的培養(yǎng)條件,采取差異貼壁法和膠原酶消化法結(jié)合去除成纖維細胞,純化細胞系。2.具有轉(zhuǎn)移潛能的人肺腺癌細胞系M-LAC的生物學(xué)特性的研究：(1)光鏡觀察細胞形態(tài)；(2)繪制細胞生長曲線、分析群體倍增時間了解細胞生長與增殖特性；(3)檢測克隆形成率了解細胞集落形成能力；(4)染色體核型分析探討細胞遺傳學(xué)特性；(5)免疫細胞化學(xué)和免疫細胞熒光鑒定M-LAC的組織起源；(6)體外侵襲模型Matrigel-Transwell小室法分析M-LAC體外侵襲能力；(7)裸小鼠皮下接種M-LAC,觀察其致瘤性,通過病理及免疫組織化學(xué)染色觀察有無淋巴道及血道的轉(zhuǎn)移；(8)檢測有無支原體的污染,判斷M-LAC是否符合建立細胞系的標(biāo)準(zhǔn)。3.研究具有轉(zhuǎn)移潛能的人肺腺癌細胞M-LAC的腫瘤干細胞和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化生物學(xué)特性：(1)流式細胞儀比較M-LAC與對照組A549的腫瘤干細胞標(biāo)志分子CD133含量的差異；(2) Western Blot法比較M-LAC與對照組A549的腫瘤干細胞標(biāo)志分子Oct4和ABCG2以及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)分子E-Cadherin和Vimentin含量的差異；(3)RT-PCR法比較M-LAC和對照組A549的腫瘤干細胞標(biāo)志物(CD133、Oct4、ABCG2)、血管生成因子VEGF-A、炎癥因子TNF-α腫瘤抑制基因p53、Rb、腫瘤促增殖基因c-myc的表達量的差異。結(jié)果：1.以人肺腺癌患者惡性腹水為瘤源,經(jīng)原代培養(yǎng)、傳代,利用差異貼壁法與膠原酶消化法結(jié)合,成功純化培養(yǎng)出具有轉(zhuǎn)移潛能的人肺腺癌細胞系M-LAC。2.具有轉(zhuǎn)移潛能的人肺腺癌細胞系M-LAC在倒置顯微鏡下呈互不重疊的單層生長,細胞形態(tài)多樣,表現(xiàn)為梭形、三角形或多角形；細胞生長群體倍增時間為29.07±0.278 h,細胞增殖能力強；克隆形成率為17.8%,集落形成能力高；染色體核型以非整倍體核型為主,亞四倍體占分析核型的35%,余可見單倍體、超三倍體等核型,細胞染色體不穩(wěn)定。免疫細胞化學(xué)結(jié)果表明90%細胞表達Ⅱ型肺泡上皮標(biāo)志蛋白SFTPC,免疫細胞熒光顯示90%細胞表達上皮來源標(biāo)志物Cytokeratin7,85%細胞表達上皮表型標(biāo)記分子E-Cadherin,另有10%細胞表達間質(zhì)表型標(biāo)記分子中間絲波形蛋白Vimentin。 Matrigel-Transwell小室法結(jié)果表明M-LAC體外侵襲能力強于對照組A549；異種動物接種裸小鼠致瘤率為100%,淋巴道轉(zhuǎn)移率50%,血道轉(zhuǎn)移率25%；細胞系在培養(yǎng)過程中無支原體污染,。符合建系的標(biāo)準(zhǔn)。3.通過流式細胞儀測得人肺腺癌細胞系M-LAC與對照組A549的腫瘤干細胞標(biāo)志分子CD133含量分別為8.095%和5.0%,M-LAC的CD133含量相對高于對照組A549。通過Western Blot法測得人肺腺癌細胞系M-LAC組腫瘤干細胞標(biāo)記分子Oct4蛋白相對表達量為3.586±0.024,對照組A549為2.912±0.013,M-LAC的Oct4蛋白的含量高于對照組A549；同時M-LAC組腫瘤干細胞標(biāo)記分子ABCG2蛋白相對表達量為3.834±0.028,對照組A549為1.561±0.016,M-LAC的 ABCG2蛋白的含量高于A549。結(jié)果提示人肺腺癌細胞系M-LAC具有轉(zhuǎn)移潛能可能與腫瘤干細胞的比例高有關(guān)。4.通過Western Blot法測得人肺腺癌細胞系M-LAC組上皮表型標(biāo)記分子E-Cadherin蛋白相對表達量為1.236±0.017,對照組A549為1.431±0.018,M-LAC的E-Cadherin蛋白的含量相對低于A549。同時測得M-LAC組間質(zhì)表型標(biāo)記分子Vimentin蛋白相對表達量為2.064±0.028,對照組A549為1.022±0.027,M-LAC的Vimentin蛋白的含量相對高于A549。結(jié)果表明上皮性標(biāo)志蛋白含量降低,間質(zhì)性蛋白含量增高,提示人肺腺癌細胞系M-LAC具有轉(zhuǎn)移潛能可能與細胞發(fā)生了上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)。5. RT-PCR法檢測結(jié)果顯示示人肺腺癌細胞系M-LAC在腫瘤干細胞標(biāo)記分子CD133、Oct4、ABCG2的基因表達量上均高于對照組A549。同時M-LAC在腫瘤抑制基因p53、Rb、促增殖基因c-myc、炎癥因子TNF-α、血管生成相關(guān)因子VEGF-A基因表達量上也相對高于對照組A549細胞。其結(jié)果可能與人肺腺癌細胞系M-LAC增殖能力高及具有轉(zhuǎn)移潛能相關(guān)。結(jié)論：1.以人肺腺癌患者惡性腹水為瘤源成功建立了具有淋巴道和血道雙向轉(zhuǎn)移潛能的人肺腺癌細胞系M-LAC (Metastastic Lung Adenoarcinoma),異種動物接種裸小鼠致瘤率為100%,且50%淋巴道轉(zhuǎn)移,25%血道轉(zhuǎn)移。2.人肺腺癌細胞系M-LAC群體倍增時間29.070±0.278 h,克隆形成率為17.8%,染色體以非整倍體核型為主,組織起源鑒定表達肺泡上皮標(biāo)志SFTPC、上皮表型標(biāo)記分子cytokeratin7和E-Cadherin,同時少量表達間葉表型標(biāo)記分子Vimentin,體外侵襲力相對高,可異種移植致瘤,細胞培養(yǎng)過程中無支原體污染,符合建系標(biāo)準(zhǔn),提示建系成功。3.人肺腺癌細胞系M-LAC的轉(zhuǎn)移潛能可能與腫瘤干細胞的比例高有關(guān),同時也可能與細胞發(fā)生了上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)。4.人肺腺癌細胞系M-LAC腫瘤抑制基因p53、Rb、促增殖基因c-myc、炎癥因子TNF-α和血管生成相關(guān)因子VEGF-A基因在基因表達水平上均相對高于對照組人肺腺癌細胞系A(chǔ)549。
【關(guān)鍵詞】：人肺腺癌細胞系 M-LAC 轉(zhuǎn)移 腫瘤干細胞 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化 基因表達
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2
【目錄】：

• 中文摘要9-13
• 英文摘要13-18
• 第一部分 具有轉(zhuǎn)移潛能的人肺腺癌細胞系M-LAC的建立18-45
• 前言18-19
• 材料和方法19-27
• 1. 研究對象19-20
• 1.1 人肺腺癌惡性腹水19
• 1.2 人肺腺癌細胞系A(chǔ)54919-20
• 1.3 實驗動物20
• 2. 主要儀器及試劑20-21
• 2.1 主要儀器20
• 2.2 主要試劑20
• 2.3 主要試劑的配制20-21
• 3. 實驗方法21-27
• 3.1 人肺腺癌細胞系M-LAC(Metastastic-Lung Adenoarcinoma)的建立21-22
• 3.2 人肺腺癌細胞系M-LAC生物學(xué)特性的研究22-27
• 3.3 統(tǒng)計學(xué)分析27
• 結(jié)果27-39
• 1. 人肺腺癌細胞系M-LAC的建立27
• 2. 人肺腺癌細胞系M-LAC的生物學(xué)特性27-39
• 2.1 人肺腺癌細胞系M-LAC的細胞形態(tài)27-28
• 2.2 人肺腺癌細胞系M-LAC細胞生長曲線和群體倍增時間28-29
• 2.3 人肺腺癌細胞系M-LAC細胞的克隆形成率29-30
• 2.4 人肺腺癌細胞系M-LAC細胞染色體核型分析30
• 2.5 人肺腺癌細胞系M-LAC組織起源鑒定30-31
• 2.6 體外侵襲模型Matrigel-Transwell小室法分析人肺腺癌細胞系M-LAC體外侵襲能力(與A549細胞對比)31-33
• 2.7 人肺腺癌細胞系M-LAC異種接種致瘤性及其病理及免疫組織化學(xué)觀察33-38
• 2.8 人肺腺癌細胞系M-LAC支原體污染的檢測38-39
• 討論39-42
• 結(jié)論42-43
• 參考文獻43-45
• 第二部分 具有轉(zhuǎn)移潛能的人肺腺癌細胞系M-LAC的腫瘤干細胞和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化生物學(xué)特性的初步研究45-67
• 前言45-46
• 材料和方法46-53
• 1. 研究對象46
• 1.1 人肺腺癌細胞系M-LAC46
• 1.2 人肺腺癌細胞系A(chǔ)54946
• 2. 主要儀器及試劑46-48
• 2.1 主要儀器46-47
• 2.2 主要試劑47
• 2.3 主要試劑的配制47-48
• 3. 實驗方法48-53
• 3.1 人肺腺癌細胞系M-LAC腫瘤干細胞和EMT生物學(xué)特性的初步研究48-49
• 3.2 人肺腺癌細胞系M-LAC的EMT生物學(xué)特性的初步研究,通過Western Blot法比較人肺腺癌細胞系M-LAC與對照A549的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)分子E-Cadherin和Vimentin含量的差異49-50
• 3.3 RT-PCR法比較人肺腺癌細胞系M-LAC和對照A549的腫瘤干細胞標(biāo)志物(CD133、Oct4、ABCG2)、血管生成因子VEGF-A、炎癥因子TNF-α、腫瘤抑制基因p53、Rb、腫瘤促增殖基因c-myc的表達量的差異50-53
• 3.4 統(tǒng)計學(xué)分析53
• 結(jié)果53-58
• 1. 人肺腺癌細胞M-LAC的腫瘤干細胞和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化生物學(xué)特性的研究53-56
• 1.1 人肺腺癌細胞系M-LAC與A549的腫瘤干細胞標(biāo)志分子CD133、Oct4和ABCG2的表達53-55
• 1.2 人肺腺癌細胞系M-LAC與A549上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)分子E-Cadherin和Vimentin的表達55-56
• 2. RT-PCR法比較人肺腺癌細胞系M-LAC和A549的腫瘤干細胞標(biāo)志物(CD133、Oct4、ABCG2)、血管生成因子VEGF-A、炎癥因子TNF-α、腫瘤抑制基因p53、Rb、腫瘤促增殖基因c-myc的基因水平的表達差異56-58
• 2.1 RT-PCR法比較人肺腺癌細胞系M-LAC和A549的腫瘤干細胞標(biāo)志物(CD133、Oct4、ABCG2)的基因水平的表達差異56-57
• 2.2 RT-PCR法比較人肺腺癌細胞系M-LAC和A549的血管生成因子VEGF-A基因水平的表達差異57
• 2.3 RT-PCR法比較人肺腺癌細胞系M-LAC和A549的炎癥因子TNF-α基因水平的表達差異57-58
• 2.4 RT-PCR法比較人肺腺癌細胞系M-LAC和A549的腫瘤抑制基因p53、Rb基因水平的表達差異58
• 2.5 RT-PCR法比較人肺腺癌細胞系M-LAC和A549的腫瘤促增殖基因c-myc基因水平的表達差異58
• 討論58-63
• 結(jié)論63-64
• 參考文獻64-67
• 綜述67-79
• 1 腫瘤干細胞的存在與肺癌干細胞的起源67-68
• 2 肺癌干細胞與肺癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性68-72
• 3 肺癌干細胞的靶向治療72-73
• 4 展望73-74
• 參考文獻74-79
• 致謝79

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 周蕾;武世伍;俞嵐;龔曉萌;宋文慶;承澤農(nóng);;非小細胞肺癌中CD133和Notch1的表達及其臨床病理意義[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2015年02期

2 李小江;張文治;張瑩;李寶樂;黃敏娜;包芳芳;吳建國;周佳靜;賈英杰;;肺癌干細胞的影響機制研究進展[J];中國腫瘤臨床;2012年09期

3 王靜;杜江;周細中;劉茹;沈蔚;王斌;;肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白C原核表達載體的構(gòu)建、表達及純化[J];中國組織工程研究;2012年15期

4 高偉;趙曉霞;郭緒曉;;肺癌患者血清IL-6、IL-8及TNF-α的表達及臨床意義[J];河北醫(yī)藥;2012年04期

5 李繼東;朱運奎;肖永久;薛慶亮;;TNF-α對三維立體培養(yǎng)的肺癌H460細胞MMP-2和MMP-9表達的影響[J];現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué);2011年12期

6 張帥;武雅琴;馮冬杰;張治;蔣峰;尹榮;許林;;miR-145通過下調(diào)OCT4基因抑制肺腺癌干細胞增殖[J];中國肺癌雜志;2011年04期

7 楊順芳;蘇建中;時梅萍;趙蘭香;張佩玲;曹杰;陸建英;謝文暉;;中國人肺腺癌細胞系CPA-Yang2的建立及其生物學(xué)特性[J];中國肺癌雜志;2009年10期

8 劉丹;李為民;莫顯明;劉倫旭;王允;車國衛(wèi);伍佇;茍繼龍;;多參數(shù)流式細胞術(shù)分析肺癌幼稚細胞免疫表型CD133、CD34、CD44的表達[J];四川大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2008年05期

9 姚明;閆明霞;劉蕾;吳海燕;莢德水;孔韓衛(wèi);張書霞;;人肺癌高轉(zhuǎn)移動物模型的篩選及其細胞系的建立[J];腫瘤;2007年11期

10 周清華,王艷萍,車國衛(wèi),朱文,陳曉禾,陳曉峰,孫芝琳;人大細胞肺癌細胞系NL9980和L9981的建立及其生物學(xué)特性研究[J];中國肺癌雜志;2003年06期

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