本文關(guān)鍵詞：抑癌基因甲基化在食管鱗癌細胞株中的表達差異及其與DNMT1的關(guān)系

  更多相關(guān)文章： 食管鱗狀細胞癌 甲基化 DNMT1 抑癌基因

【摘要】：目的:應(yīng)用靶向DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)基因的短發(fā)夾RNA(shRNA)重組質(zhì)粒來轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的食管鱗癌細胞,并建立裸鼠的動物移植瘤模型,研究其對食管鱗癌細胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲的影響。方法:1.實驗組予以shRNA-DNMT1序列進行轉(zhuǎn)染,對照組僅予以shRNA-NC陰性對照序列,構(gòu)建沉默DNMT1基因的重組慢病毒并感染食管鱗癌細胞后獲得穩(wěn)定細胞株,建立裸鼠的動物移植瘤模型。2.cell counting kit 8(CCK-8)檢測細胞增殖生長能力。3.集落形成實驗檢測細胞形成集落的能力。4.Transwell實驗檢測腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。5.流式細胞儀檢測腫瘤細胞的凋亡與周期。6.實時熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測食管鱗癌細胞和裸鼠移植瘤組織中抑癌基因P16、CDH13、RASSF1A、APC、MGMT、ASC、DAPK和DNMT1的mRNA表達。7.甲基化特異性PCR(Methylation specific PCR,MSP)檢測食管鱗癌細胞和裸鼠移植瘤組織中抑癌基因RASSF1A和DAPK的甲基化狀態(tài)。8.Western blot檢測食管鱗癌細胞和裸鼠移植瘤組織中抑癌基因RASSF1A和DAPK所調(diào)控的蛋白和DNMT1蛋白的表達。9.免疫組化檢測裸鼠移植瘤組織中RASSF1A和DAPK蛋白的表達。結(jié)果:1.成功構(gòu)建沉默DNMT1基因的重組慢病毒并感染食管鱗癌細胞,獲得穩(wěn)定細胞株。2.與對照組比較,qRT-PCR結(jié)果表明食管鱗癌細胞和裸鼠移植瘤中實驗組DNMT1的mRNA表達明顯減少,而RASSF1A和DAPK的mRNA表達明顯增多(P0.01)。3.Western blot表明食管鱗癌細胞和裸鼠移植瘤中實驗組DNMT1蛋白水平明顯降低,而RASSF1A和DAPK所表達的蛋白水平明顯增多(P0.05)。4.CCK檢測表明實驗組中細胞增殖速度明顯減慢(P0.05)。5.集落形成實驗表明實驗組中細胞的集落數(shù)明顯減少(P0.01)。6.Transwell實驗表明實驗組中食管鱗癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力明顯減弱(P0.01)。7.流式細胞儀檢測結(jié)果顯示:與對照組相比實驗組食管癌細胞的凋亡細胞百分比增高(P0.01),集中在早調(diào)階段;與對照組相比,實驗組食管癌細胞呈現(xiàn)以下改變:DNA合成前期(G0/G1期)細胞的百分比增高(P0.001),DNA合成期(S期)細胞的百分比減少(P0.001),DNA合成后期(G2/M期)細胞的百分比減少(P0.001)。8.免疫組化表明裸鼠移植瘤中實驗組RASSF1A和DAPK蛋白表達明顯增多(P0.05)。9.甲基化特異性PCR(MSP)表明食管鱗癌細胞和裸鼠移植瘤中實驗組RASSF1A和DAPK的甲基化受到抑制。結(jié)論:沉默DNMT1可以通過調(diào)節(jié)RASSF1A和DAPK基因甲基化的途徑從而抑制食管鱗癌細胞的增殖,轉(zhuǎn)移和侵襲。
【關(guān)鍵詞】：食管鱗狀細胞癌 甲基化 DNMT1 抑癌基因
【學(xué)位授予單位】：桂林醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.1
【目錄】：

• 中文摘要6-8
• ABSTRACT8-12
• 英漢縮略詞對照表12-13
• 前言13-16
• 第一部分 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的建立16-37
• 1 材料與方法16-28
• 1.1 實驗材料與儀器16
• 1.2 主要實驗試劑16-18
• 1.3 主要實驗儀器18
• 1.4 實驗方法18-28
• 2 結(jié)果28-31
• 2.1 DNMT1沉默載體轉(zhuǎn)染效率的確定28
• 2.2 穩(wěn)定沉默細胞的DNMT1m RNA表達檢測28-30
• 2.3 穩(wěn)定沉默細胞的DNMT1蛋白表達檢測30-31
• 3 討論31-33
• 4 結(jié)論33-34
• 參考文獻34-37
• 第二部分 DNMT1對食管鱗癌影響的體外實驗37-63
• 1 材料與方法37-45
• 1.1 實驗材料與儀器37
• 1.2 主要實驗試劑37-38
• 1.3 主要實驗儀器38
• 1.4 實驗方法38-45
• 2 結(jié)果45-56
• 2.1 CCK-8 法檢測食管鱗癌細胞增殖情況45
• 2.2 集落形成實驗45-46
• 2.3 Transwell遷移實驗46-47
• 2.4 Transwell侵襲實驗47-48
• 2.5 細胞周期48-49
• 2.6 細胞凋亡49-50
• 2.7 腫瘤相關(guān)抑癌基因m RNA表達的檢測50-54
• 2.8 腫瘤相關(guān)抑癌基因蛋白表達的檢測54-55
• 2.9 腫瘤相關(guān)抑癌基因DAPK和RASSF1A甲基化的檢測55-56
• 3 討論56-58
• 4 結(jié)論58-59
• 參考文獻59-63
• 第三部分 沉默DNMT1對裸鼠移植瘤生長的影響63-79
• 1 材料與方法63-69
• 1.1 實驗材料與儀器63
• 1.2 主要實驗試劑63-65
• 1.3 主要實驗儀器65
• 1.4 實驗方法65-69
• 2 結(jié)果69-75
• 2.1 裸鼠體內(nèi)移植瘤的生長情況69-70
• 2.2 裸鼠腫瘤組織中DNMT1和抑癌基因DAPK、RASSF1A的表達70-73
• 2.3 免疫組化檢測裸鼠移植瘤組織中抑癌基因DAPK和RASSF1A的表達73
• 2.4 甲基化特異性PCR檢測裸鼠移植瘤組織中抑癌基因DAPK和RASSF1A的甲基化狀態(tài)73-75
• 3 討論75-77
• 4 結(jié)論77-78
• 參考文獻78-79
• 全文總結(jié)79-80
• 綜述80-92
• 參考文獻86-92
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄92-93
• 致謝93

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前9條

1 靳義;劉俊峰;;基因甲基化與去甲基化在食管癌中的研究進展[J];食管外科電子雜志;2013年04期

2 章金強;劉季春;;E-鈣黏附素基因甲基化及蛋白的表達在食管癌中的研究進展[J];南昌大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2012年01期

3 張江蘭;楊燕君;張曉麗;;DNA甲基化與食管癌關(guān)系研究進展[J];河北北方學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版);2011年02期

4 ;Circulating microRNAs: Novel biomarkers for esophageal cancer[J];World Journal of Gastroenterology;2010年19期

5 王巍偉;李鋒;;食管癌相關(guān)基因甲基化研究進展[J];臨床與實驗病理學(xué)雜志;2009年06期

6 宋長山;譚家駒;崔金環(huán);徐致祥;楊光;司建華;;食管鱗癌中p16基因啟動子區(qū)甲基化及其表達[J];腫瘤防治研究;2008年01期

7 丁士剛;吳笛;鄒檢平;邢秀娟;魯鳳民;陳香梅;;食管鱗癌RASSF1A基因啟動子區(qū)甲基化研究[J];中國微創(chuàng)外科雜志;2007年12期

8 張功員;劉秋亮;樂曉萍;丁一;張欽憲;;食管癌組織hMSH2 mRNA的表達和啟動子區(qū)甲基化[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2007年11期

9 宋長山;楊光;譚家駒;;DNA甲基化與食管癌的關(guān)系[J];中華腫瘤防治雜志;2007年01期

，

本文編號：954136