本文關(guān)鍵詞：microRNA-100對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制探討

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【摘要】：[研究背景]肺癌是全球發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤,也是我國最常見的惡性腫瘤。近年來,包括我國在內(nèi)的多數(shù)國家肺癌呈現(xiàn)高發(fā)與早發(fā)的趨勢。在我國,因肺癌死亡者,男性居惡性腫瘤死亡的首位,女性也高居第二位。肺癌發(fā)生的病因及其確切的分子機(jī)制尚不十分清楚�，F(xiàn)有的研究表明,導(dǎo)致肺癌發(fā)生的原因眾多,吸煙可誘發(fā)肺癌；此外,有研究發(fā)現(xiàn)在遺傳因素中,某個(gè)或多個(gè)基因的改變也會導(dǎo)致肺癌的發(fā)生。近期有研究表明,超過60種DNA分子在發(fā)生突變后會增加罹患肺癌的機(jī)率。由于肺癌的死亡人數(shù)一直居高不下,因此我們更需要對其發(fā)生、發(fā)展的原因和相關(guān)機(jī)制進(jìn)行深入的研究。我們利用現(xiàn)有的分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)了解了肺癌在發(fā)生與發(fā)展過程中的一些機(jī)制,但想要全面地了解肺癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)機(jī)制,我們還需要尋找更多的分子標(biāo)記物。在這些有待發(fā)現(xiàn)的分子生物標(biāo)記中,microRNA的發(fā)現(xiàn)引起了廣泛關(guān)注,它可以通過表觀遺傳學(xué)機(jī)制來調(diào)控基因的表達(dá)。微小RNA (microRNA, miRNA)是一類非編碼的單鏈小分子RNA,長度約為18-23個(gè)核苷酸,廣泛存在于真核生物中。miRNA通過與靶基因的mRNA3'UTR不完全性地互補(bǔ)配對,從而抑制靶mRNA的翻譯或者促使其降解,即在轉(zhuǎn)錄后水平與翻譯水平調(diào)節(jié)靶蛋白的表達(dá)。目前對miRNA的研究發(fā)現(xiàn),大約70%miRNA可調(diào)控人類基因表達(dá)�，F(xiàn)有的研究證實(shí)miRNA在肺癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用,而根據(jù)其作用的靶基因的不同,又將其分為具有癌基因或者抑癌基因生物學(xué)活性的miRNA。miR-100定位于人類染色體11q24.1,大小約為22個(gè)核苷酸�，F(xiàn)有的研究表明,miR-100在不同的病變中呈現(xiàn)不同的表達(dá)方式。已有研究報(bào)道在膀胱癌細(xì)胞中,miRNA-100通過下調(diào)其靶基因mTOR,從而抑制膀胱癌細(xì)胞的生長、增殖。Deng等人研究證實(shí),miRNA-100能夠抑制乳腺癌干細(xì)胞(BrCSCs)的自我更新和分化能力,從而影響乳腺癌的進(jìn)展。我們在前期的研究中發(fā)現(xiàn)miR-100在正常的人支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B中高表達(dá),而在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)細(xì)胞株中低表達(dá)。miR-100的生物學(xué)功能在NSCLC中未見深入研究。腫瘤細(xì)胞的快速增殖是實(shí)體腫瘤進(jìn)展的先決條件,其中涉及到多種調(diào)控基因的功能缺失和表達(dá)異常。那么miR-100表達(dá)的下調(diào)對NSCLC的惡性進(jìn)展是否起到促進(jìn)作用?以及miR-100是如何促進(jìn)NSCLC惡性進(jìn)展的?本課題在結(jié)合miR-100在NSCLC的細(xì)胞株以及臨床病例標(biāo)本中的表達(dá)情況,通過改變NSCLC細(xì)胞中miR-100表達(dá)水平,然后在體外實(shí)驗(yàn)中檢測NSCLC細(xì)胞株在增殖、周期以及轉(zhuǎn)移方面的變化,并進(jìn)一步探討導(dǎo)致這些變化的相關(guān)機(jī)制,從而為NSCLC的臨床診斷和治療提供新的線索。[研究方法]1.用qRT-PCR檢測人支氣管上皮細(xì)胞(BEAS-2B)和NSCLC (A549、L18)細(xì)胞株,以及20例未經(jīng)治療的NSCLC患者組織標(biāo)本和16名健康對照者的血清標(biāo)本中miR-100的表達(dá)情況。2.以慢病毒為載體分別建立穩(wěn)定表達(dá)miR-100-3p inhibitor negative control和miR-100-3p mimics negative control的A549、L18細(xì)胞株。3.用上述已經(jīng)構(gòu)建的穩(wěn)定細(xì)胞株來研究miR-100-3p在NSCLC細(xì)胞中生物學(xué)功能。(1)MTT法和平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測A549和L18細(xì)胞株的細(xì)胞增殖能力,并繪制生長曲線。(2)流式細(xì)胞術(shù)檢測A549和L18細(xì)胞株的細(xì)胞周期的變化情況。(3)細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)檢測A549和L18細(xì)胞株細(xì)胞黏附能力。(4)軟瓊脂半固體集落形成實(shí)驗(yàn)檢測A549和L18細(xì)胞株的非錨定生長能力。(5) Transwell/Matrigel法檢測A549和L18細(xì)胞株遷移和侵襲的能力。4.用Western blotting檢測EMT相關(guān)marker,以及Frizzld-8、GSK-3β、β-catenin蛋白的表達(dá)情況。[研究結(jié)果]1.與人支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B細(xì)胞比較,miR-100在肺癌細(xì)胞株,尤其是NSCLC細(xì)胞株A549和L18細(xì)胞株中低表達(dá)(p0.01)；在20例NSCLC患者和相應(yīng)的16例健康對照者的血清及其組織標(biāo)本中檢測發(fā)現(xiàn),NSCLC患者中miR-100低表達(dá)(p0.001)。2.成功構(gòu)建了敲低miR-100-3p表達(dá)的A549細(xì)胞株,以及過表達(dá)miR-100-3p的L18細(xì)胞株。3. miR-100-3p對肺癌細(xì)胞生長的影響：MTT和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在A549細(xì)胞株中敲低miR-100-3p的表達(dá)后,細(xì)胞增殖率以及細(xì)胞克隆形成率明顯增加；而在L18細(xì)胞株中過表達(dá)miR-100-3p后,細(xì)胞增殖率與細(xì)胞克隆形成率明顯降低。以上結(jié)果表明miR-100-3p的缺失促進(jìn)了肺癌細(xì)胞的增殖和克隆形成能力。4. miR-100-3p對肺癌細(xì)胞周期的影響：流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期結(jié)果顯示,在A549細(xì)胞株中敲低miR-100-3p的表達(dá)后,處于S期的細(xì)胞比例顯著增高；而在L18細(xì)胞株中過表達(dá)miR-100-3p后,處于S期的細(xì)胞比例明顯降低。這說明miR-100-3p的缺失使得肺癌細(xì)胞中S期細(xì)胞比例增加。5. miR-100-3p對肺癌細(xì)胞非錨定生長能力的影響：軟瓊脂集落形成試驗(yàn)結(jié)果顯示,在A549細(xì)胞株中敲低miR-100-3p的表達(dá)后,與對照組相比,實(shí)驗(yàn)組集落形成個(gè)數(shù)明顯增多并且體積較大；而在L18細(xì)胞株中過表達(dá)miR-100-3p后,實(shí)驗(yàn)組集落形成個(gè)數(shù)明顯減少并且體積較小。以上結(jié)果表明miR-100-3p的缺失促進(jìn)了肺癌細(xì)胞的非錨定生長能力。6. miR-100-3p對肺癌細(xì)胞黏附能力的影響：粘附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在A549細(xì)胞株中敲低miR-100-3p的表達(dá)后,細(xì)胞的粘附能力增強(qiáng)；而在L18細(xì)胞株中過表達(dá)miR-100-3p后,細(xì)胞的粘附能力降低。以上結(jié)果表明miR-100-3p的缺失增強(qiáng)了肺癌細(xì)胞的粘附能力。7. miR-100-3p對肺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響：Transwell小室檢測結(jié)果顯示,在A549細(xì)胞株中敲低miR-100-3p的表達(dá)后,細(xì)胞的遷移與侵襲能力顯著增強(qiáng)；而在L18細(xì)胞株中過表達(dá)miR-100-3p后,細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯減弱。以上結(jié)果表明miR-100-3p的缺失增強(qiáng)了肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。8. miR-100-3p的缺失參與了EMT的發(fā)生：細(xì)胞形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在A549細(xì)胞株中敲低miR-100-3p的表達(dá)后,細(xì)胞間連接變得松散。Western Blotting實(shí)驗(yàn)顯示,上皮樣marker鈣黏蛋白(E-cadherin)表達(dá)減少,而間質(zhì)樣marker波形蛋白(Vimentin)表達(dá)增加。9.相關(guān)機(jī)制初步探討：(1) Western blotting檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),在A549細(xì)胞株中敲低miR-100-3p的表達(dá)后,EMT間質(zhì)樣marker呈表達(dá)上調(diào)趨勢,而上皮樣marker呈表達(dá)下調(diào)趨勢；而在L18細(xì)胞株中過表達(dá)miR-100-3p后,間質(zhì)樣marker呈表達(dá)下調(diào)趨勢,而上皮樣marker呈表達(dá)上調(diào)趨勢。以上結(jié)果表明miR-100-3p的缺失使得A549細(xì)胞發(fā)生了EMT樣變化。(2) Western blotting檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),在改變肺癌細(xì)胞株中miR-100-3p的表達(dá)后,Frizzld-8、GSK-3p、p-catenin蛋白的表達(dá)水平呈現(xiàn)明顯的改變。這表明miR-100-3p參與了Wnt/β-catenin通路的調(diào)節(jié)。[結(jié)論]1.成功構(gòu)建了低表達(dá)miR-100-3p的A549細(xì)胞株,以及過表達(dá)miR-100-3p的L18細(xì)胞株。2. miR-100-3p的低表達(dá)促進(jìn)了NSCLC細(xì)胞的增殖、黏附、遷移、侵襲和非錨定生長能力,其在NSCLC進(jìn)展中起到抑癌基因的作用。3. miR-100-3p促進(jìn)NSCLC細(xì)胞惡性生物學(xué)進(jìn)程,在此過程中EMT起著至關(guān)重要的作用；與此同時(shí),miR-100-3p可能通過靶向作用于FZD8激活Wnt/β-catenin信號通路,從而促進(jìn)NSCLC細(xì)胞惡性進(jìn)展。
【關(guān)鍵詞】：非小細(xì)胞肺癌 microRNA miR-100-3p EMT Wnt/β-catenin信號通路
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2
【目錄】：

• 中英文縮寫一覽表5-6
• 中文摘要6-11
• ABSTRACT11-16
• 1. 前言16-20
• 2. 材料與方法20-39
• 3. 結(jié)果39-54
• 4. 討論54-57
• 5. 結(jié)論57
• 參考文獻(xiàn)57-65
• 附錄65-66
• 致謝66-67
• 綜述67-78
• 參考文獻(xiàn)72-78

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本文編號：951209