本文關(guān)鍵詞：shRNA LKB1慢病毒載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)染和表達(dá)的研究

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【摘要】：目的:構(gòu)建針對人LKB1(liver kinase B1,或STK11 serine/threonine protein kinase11)基因的特異性短發(fā)卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)表達(dá)的慢病毒載體,并觀察轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞Huh7后對LKB1 mRNA和蛋白的表達(dá)。方法:根據(jù)人LKB1的基因信息,設(shè)計(jì)3條針對LKB1基因cds區(qū)的si RNA序列,同時(shí)設(shè)計(jì)1條negative序列用于RNAi陰性對照(Negative Control,NC),組建與shRNA相對應(yīng)的4對互補(bǔ)的單鏈DNA。將合成的序列插入空載體GV115(元件順序?yàn)?hU6-MCS-CMV-EGFP)中,重組獲得慢病毒載體。進(jìn)行測序鑒定后,再轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞產(chǎn)生病毒液,得到的病毒液再轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株Huh7。熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的情況,實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞LKB1 mRNA的表達(dá)情況,Western印跡法檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞LKB1蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果:成功構(gòu)建含shRNA LKB1的慢病毒載體,人肝癌細(xì)胞株Huh7轉(zhuǎn)染后LKB1mRNA和蛋白表達(dá)顯著下調(diào)。結(jié)合感染后的細(xì)胞照片,判定shRNA LKB1-2(KD2)組為有效靶點(diǎn)組。結(jié)論:成功獲得阻斷人肝癌細(xì)胞株Huh7 LKB1表達(dá)的shRNA序列,并構(gòu)建慢病毒載體,人肝癌細(xì)胞株Huh7轉(zhuǎn)染后LKB1 mRNA和蛋白表達(dá)顯著下調(diào),為后期研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：shRNA LKB1 人肝癌細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 摘要3-4
• ABSTRACT4-8
• 中英文縮略詞表8-9
• 第1章 引言9-10
• 第2章 材料與方法10-22
• 2.1 菌株及細(xì)胞株、主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器等10-16
• 2.1.1 菌株及細(xì)胞株10
• 2.1.2 主要試劑10-11
• 2.1.3 主要試劑的配制11-14
• 2.1.4 主要儀器、材料14-15
• 2.1.5 載體信息15-16
• 2.2 慢病毒載體的構(gòu)建16-17
• 2.2.1 LKB1干擾序列的設(shè)計(jì)16
• 2.2.2 克隆制備與鑒定16
• 2.2.3 慢病毒的包裝與滴度檢測16-17
• 2.3 慢病毒感染細(xì)胞17-19
• 2.3.1 準(zhǔn)備目的細(xì)胞17
• 2.3.2 目的細(xì)胞慢病毒感染預(yù)實(shí)驗(yàn)17-18
• 2.3.3 目的細(xì)胞慢病毒轉(zhuǎn)染18-19
• 2.4 PCR檢測細(xì)胞LKB1的MRNA水平19
• 2.5 WESTERN BLOT檢測細(xì)胞LKB1蛋白的表達(dá)水平19-21
• 2.6 統(tǒng)計(jì)處理21-22
• 第3章 結(jié)果22-26
• 3.1 慢病毒感染后細(xì)胞圖片22
• 3.2 REAL-TIME PCR檢測感染效果22-25
• 3.3 WESTERN BLOT檢測蛋白表達(dá)水平25-26
• 第4章 討論26-29
• 第5章 結(jié)論與展望29-30
• 致謝30-31
• 參考文獻(xiàn)31-34
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果34-35
• 綜述35-42
• 參考文獻(xiàn)40-42

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 周小智;薛耀明;高方;朱波;關(guān)美萍;;二甲雙胍對AGEs誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞SW-480增殖作用的影響及機(jī)制的初探[J];中國糖尿病雜志;2012年07期

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本文編號：945134