本文關(guān)鍵詞：TGF-β1誘導(dǎo)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞TE13發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及其參與放射抗性的分子機(jī)制

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【摘要】：目的:以體外培養(yǎng)的食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株TE13為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,通過(guò)放射線反復(fù)照射篩選出的具有EMT樣表型的放射抗性細(xì)胞株TE13R120,并利用轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(Transforming Growth Factor-β1,TGF-β1)誘導(dǎo)TE13細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT),建立EMT細(xì)胞模型。對(duì)TE13細(xì)胞株、EMT模型細(xì)胞和TE13R120細(xì)胞進(jìn)行Real-Time PCR、Western blot、免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè),測(cè)定這三株細(xì)胞株中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體(neurotrophin receptor p75 interacting MAGE homologue,NRAGE)基因的表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)定位情況。探討食管癌細(xì)胞中NRAGE亞細(xì)胞定位在EMT與放射抗性形成中的作用,對(duì)深入研究食管癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為具有重要意義,為放射抗性造成的放療失敗提供一種新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù),同時(shí)也為腫瘤治療提供了新的靶點(diǎn)。方法:人食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株TE13常規(guī)培養(yǎng),待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為三組:TE13細(xì)胞組、EMT細(xì)胞模型組、TE13R120細(xì)胞組,通過(guò)Real-Time PCR、Western blot和免疫細(xì)胞化學(xué)三種實(shí)驗(yàn)技術(shù)分別檢測(cè)NRAGE的m RNA表達(dá)情況及總蛋白、胞漿蛋白、胞核蛋白的表達(dá)情況。其中TE13R120細(xì)胞株經(jīng)過(guò)放射線反復(fù)照射篩選TE13累積劑量120Gy所得,通過(guò)細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其放射抗性。并通過(guò)倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變,通過(guò)Western blot、Real-Time PCR檢測(cè)EMT相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin、Vimentin的蛋白表達(dá)和m RNA表達(dá)情況驗(yàn)證EMT樣表型的存在。EMT細(xì)胞模型利用TGF-β1誘導(dǎo)TE13細(xì)胞株所得,并通過(guò)倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變,Western blot、Real-Time PCR檢測(cè)EMT相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin、Vimentin的蛋白表達(dá)和m RNA表達(dá)情況驗(yàn)證是否誘導(dǎo)成功。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組之間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P0.05即認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。1建立放射抗性細(xì)胞株TE13R120,并驗(yàn)證其放射抗性及存在EMT樣表型建立TE13R120細(xì)胞后,進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)擬合細(xì)胞存活曲線,計(jì)算TE13及TE13R120細(xì)胞放射敏感性參數(shù)D0、Dq、N值和SF2,TE13細(xì)胞分別為:2.242、0.854、1.465、0.538;TE13R120細(xì)胞分別為:2.499、1.991、2.219、0.734。倒置顯微鏡下觀察對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的單層細(xì)胞TE13細(xì)胞株和TE13R120細(xì)胞株形態(tài)學(xué)差異,TE13細(xì)胞株為不規(guī)則的多邊形,細(xì)胞間邊界不清,呈片狀生長(zhǎng);而TE13R120細(xì)胞株則細(xì)長(zhǎng)呈梭行或紡錘形,細(xì)胞極性消失。Western blot檢測(cè)EMT相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin、Vimentin的蛋白表達(dá)情況,TE13細(xì)胞組的E-cadherin表達(dá)(403.526±32.684)高于TE13R120細(xì)胞組(132.291±6.542)(P0.05);TE13細(xì)胞組的Vimentin表達(dá)(86.438±4.387)低于TE13R120細(xì)胞組(400.324±5.698)(P0.05)。Real-Time PCR檢測(cè)EMT相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin、Vimentin的m RNA表達(dá)情況。TE13細(xì)胞組的E-cadherin表達(dá)(1.576±0.290)高于TE13R120細(xì)胞組(0.095±0.052)(P0.05);TE13細(xì)胞組的Vimentin表達(dá)(1.015±0.236)低于TE13R120細(xì)胞組(23.145±1.131)(P0.05)。2 TGF-β1誘導(dǎo)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株TE13細(xì)胞發(fā)生EMT取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的單層細(xì)胞于倒置顯微鏡下觀察,TGF-β1(10ng/ml)刺激TE13細(xì)胞株48h后發(fā)生的形態(tài)學(xué)改變,細(xì)胞由不規(guī)則的多邊形轉(zhuǎn)變?yōu)榧忓N形;細(xì)胞間的結(jié)合由緊密變?yōu)槭杷�。Western blot檢測(cè)EMT相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin、Vimentin的蛋白表達(dá)情況,TE13細(xì)胞組的E-cadherin表達(dá)(403.526±32.684)高于EMT細(xì)胞模型組(156.369±5.722)(P0.05);TE13細(xì)胞組的Vimentin表達(dá)(86.438±4.387)低于EMT細(xì)胞模型組(389.324±9.378)(P0.05)。Real-Time PCR檢測(cè)EMT相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin、Vimentin的m RNA表達(dá)情況。TE13細(xì)胞組的E-cadherin表達(dá)(1.576±0.290)高于EMT細(xì)胞模型組(0.213±0.142)(P0.05);TE13細(xì)胞組的Vimentin表達(dá)(1.015±0.236)低于EMT細(xì)胞模型組(22.848±0.211)(P0.05)。3 NRAGE在三組細(xì)胞中的表達(dá)情況通過(guò)Real-Time PCR、Western blot、免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)對(duì)NRAGE在TE13細(xì)胞組、EMT細(xì)胞模型組、TE13R120細(xì)胞組中的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。Real-Time PCR檢測(cè)NRAGE的m RNA表達(dá)情況,TE13細(xì)胞組(1.6826±0.749)分別低于EMT細(xì)胞模型組(5.253±0.916)(P0.05)和TE13R120細(xì)胞組(5.562±2.212)(P0.05);EMT細(xì)胞模型組與TE13R120細(xì)胞組之間無(wú)差別(P0.05)。Western blot檢測(cè)NRAGE的蛋白表達(dá)情況,TE13細(xì)胞組(34.408±3.267)分別低于EMT細(xì)胞模型組(160.327±15.797)(P0.05)和TE13R120細(xì)胞組(163.472±13.583)(P0.05);EMT細(xì)胞模型組與TE13R120細(xì)胞組之間無(wú)差別(P0.05)。進(jìn)一步運(yùn)用Western blot檢測(cè)NRAGE在胞漿和胞核中蛋白表達(dá)情況。通過(guò)對(duì)三組細(xì)胞胞漿中NRAGE蛋白表達(dá)情況進(jìn)行兩兩比較,三者比較均無(wú)差別(P(TE13 VS.EMT)0.05、P(TE13 VS.TE13R120)0.05、P(TE13R120 VS.EMT)0.05);兩兩比較在胞核中表達(dá)情況是否存在差別:TE13細(xì)胞組(45.384±3.680)分別低于EMT細(xì)胞模型組(198.345±26.265)和TE13R120細(xì)胞組(210.589±30.211),且均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P(TE13 VS.EMT)0.05、P(TE13 VS.TE13R120)0.05),EMT細(xì)胞模型組與TE13R120細(xì)胞組間則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)NRAGE在三組細(xì)胞中定位及胞漿胞核表達(dá)情況,三組細(xì)胞胞漿中的表達(dá)情況無(wú)明顯差別(P(TE13 VS.EMT)0.05、P(TE13 VS.TE13R120)0.05、P(TE13R120 VS.EMT)0.05),胞核中EMT細(xì)胞模型組和TE13R120細(xì)胞組表達(dá)明顯多于TE13細(xì)胞組(P(TE13 VS.EMT)0.05、P(TE13 VS.TE13R120)0.05),而EMT細(xì)胞模型組和TE13R120細(xì)胞組間則無(wú)明顯差別(P0.05)。結(jié)論:1 NRAGE亞細(xì)胞定位參與放射抗性的形成;2 EMT參與NRAGE亞細(xì)胞定位從而促進(jìn)放射抗性的形成。
【關(guān)鍵詞】：食管鱗狀細(xì)胞癌 放射抗性 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 NRAGE TGF-β1
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.1
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-10
• 英文縮寫(xiě)10-11
• 前言11-12
• 材料與方法12-23
• 結(jié)果23-26
• 附圖26-29
• 附表29-31
• 討論31-33
• 結(jié)論33-34
• 參考文獻(xiàn)34-37
• 綜述EMT參與放射抗性形成的分子機(jī)制37-43
• 參考文獻(xiàn)40-43
• 致謝43-44
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷44

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本文編號(hào)：943893