本文關(guān)鍵詞：TGF-β1誘導食管鱗狀細胞癌細胞TE13發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及其參與放射抗性的分子機制

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【摘要】：目的:以體外培養(yǎng)的食管鱗狀細胞癌細胞株TE13為實驗對象,通過放射線反復照射篩選出的具有EMT樣表型的放射抗性細胞株TE13R120,并利用轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transforming Growth Factor-β1,TGF-β1)誘導TE13細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT),建立EMT細胞模型。對TE13細胞株、EMT模型細胞和TE13R120細胞進行Real-Time PCR、Western blot、免疫細胞化學檢測,測定這三株細胞株中神經(jīng)營養(yǎng)因子受體(neurotrophin receptor p75 interacting MAGE homologue,NRAGE)基因的表達和細胞內(nèi)定位情況。探討食管癌細胞中NRAGE亞細胞定位在EMT與放射抗性形成中的作用,對深入研究食管癌細胞的惡性生物學行為具有重要意義,為放射抗性造成的放療失敗提供一種新的思路和實驗依據(jù),同時也為腫瘤治療提供了新的靶點。方法:人食管鱗狀細胞癌細胞株TE13常規(guī)培養(yǎng),待細胞進入對數(shù)生長期后用于實驗。實驗分為三組:TE13細胞組、EMT細胞模型組、TE13R120細胞組,通過Real-Time PCR、Western blot和免疫細胞化學三種實驗技術(shù)分別檢測NRAGE的m RNA表達情況及總蛋白、胞漿蛋白、胞核蛋白的表達情況。其中TE13R120細胞株經(jīng)過放射線反復照射篩選TE13累積劑量120Gy所得,通過細胞克隆形成實驗驗證其放射抗性。并通過倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)學改變,通過Western blot、Real-Time PCR檢測EMT相關(guān)標志物E-cadherin、Vimentin的蛋白表達和m RNA表達情況驗證EMT樣表型的存在。EMT細胞模型利用TGF-β1誘導TE13細胞株所得,并通過倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)學改變,Western blot、Real-Time PCR檢測EMT相關(guān)標志物E-cadherin、Vimentin的蛋白表達和m RNA表達情況驗證是否誘導成功。統(tǒng)計學方法采用SPSS17.0軟件包進行數(shù)據(jù)分析,計量資料以均數(shù)±標準差表示,兩組之間的比較采用獨立樣本t檢驗,P0.05即認為有統(tǒng)計學意義。1建立放射抗性細胞株TE13R120,并驗證其放射抗性及存在EMT樣表型建立TE13R120細胞后,進行克隆形成實驗擬合細胞存活曲線,計算TE13及TE13R120細胞放射敏感性參數(shù)D0、Dq、N值和SF2,TE13細胞分別為:2.242、0.854、1.465、0.538;TE13R120細胞分別為:2.499、1.991、2.219、0.734。倒置顯微鏡下觀察對數(shù)生長期的單層細胞TE13細胞株和TE13R120細胞株形態(tài)學差異,TE13細胞株為不規(guī)則的多邊形,細胞間邊界不清,呈片狀生長;而TE13R120細胞株則細長呈梭行或紡錘形,細胞極性消失。Western blot檢測EMT相關(guān)標志物E-cadherin、Vimentin的蛋白表達情況,TE13細胞組的E-cadherin表達(403.526±32.684)高于TE13R120細胞組(132.291±6.542)(P0.05);TE13細胞組的Vimentin表達(86.438±4.387)低于TE13R120細胞組(400.324±5.698)(P0.05)。Real-Time PCR檢測EMT相關(guān)標志物E-cadherin、Vimentin的m RNA表達情況。TE13細胞組的E-cadherin表達(1.576±0.290)高于TE13R120細胞組(0.095±0.052)(P0.05);TE13細胞組的Vimentin表達(1.015±0.236)低于TE13R120細胞組(23.145±1.131)(P0.05)。2 TGF-β1誘導食管鱗狀細胞癌細胞株TE13細胞發(fā)生EMT取對數(shù)生長期的單層細胞于倒置顯微鏡下觀察,TGF-β1(10ng/ml)刺激TE13細胞株48h后發(fā)生的形態(tài)學改變,細胞由不規(guī)則的多邊形轉(zhuǎn)變?yōu)榧忓N形;細胞間的結(jié)合由緊密變?yōu)槭杷�。Western blot檢測EMT相關(guān)標志物E-cadherin、Vimentin的蛋白表達情況,TE13細胞組的E-cadherin表達(403.526±32.684)高于EMT細胞模型組(156.369±5.722)(P0.05);TE13細胞組的Vimentin表達(86.438±4.387)低于EMT細胞模型組(389.324±9.378)(P0.05)。Real-Time PCR檢測EMT相關(guān)標志物E-cadherin、Vimentin的m RNA表達情況。TE13細胞組的E-cadherin表達(1.576±0.290)高于EMT細胞模型組(0.213±0.142)(P0.05);TE13細胞組的Vimentin表達(1.015±0.236)低于EMT細胞模型組(22.848±0.211)(P0.05)。3 NRAGE在三組細胞中的表達情況通過Real-Time PCR、Western blot、免疫細胞化學技術(shù)對NRAGE在TE13細胞組、EMT細胞模型組、TE13R120細胞組中的表達情況進行檢測。Real-Time PCR檢測NRAGE的m RNA表達情況,TE13細胞組(1.6826±0.749)分別低于EMT細胞模型組(5.253±0.916)(P0.05)和TE13R120細胞組(5.562±2.212)(P0.05);EMT細胞模型組與TE13R120細胞組之間無差別(P0.05)。Western blot檢測NRAGE的蛋白表達情況,TE13細胞組(34.408±3.267)分別低于EMT細胞模型組(160.327±15.797)(P0.05)和TE13R120細胞組(163.472±13.583)(P0.05);EMT細胞模型組與TE13R120細胞組之間無差別(P0.05)。進一步運用Western blot檢測NRAGE在胞漿和胞核中蛋白表達情況。通過對三組細胞胞漿中NRAGE蛋白表達情況進行兩兩比較,三者比較均無差別(P(TE13 VS.EMT)0.05、P(TE13 VS.TE13R120)0.05、P(TE13R120 VS.EMT)0.05);兩兩比較在胞核中表達情況是否存在差別:TE13細胞組(45.384±3.680)分別低于EMT細胞模型組(198.345±26.265)和TE13R120細胞組(210.589±30.211),且均具有統(tǒng)計學意義(P(TE13 VS.EMT)0.05、P(TE13 VS.TE13R120)0.05),EMT細胞模型組與TE13R120細胞組間則無統(tǒng)計學意義(P0.05)。免疫細胞化學檢測NRAGE在三組細胞中定位及胞漿胞核表達情況,三組細胞胞漿中的表達情況無明顯差別(P(TE13 VS.EMT)0.05、P(TE13 VS.TE13R120)0.05、P(TE13R120 VS.EMT)0.05),胞核中EMT細胞模型組和TE13R120細胞組表達明顯多于TE13細胞組(P(TE13 VS.EMT)0.05、P(TE13 VS.TE13R120)0.05),而EMT細胞模型組和TE13R120細胞組間則無明顯差別(P0.05)。結(jié)論:1 NRAGE亞細胞定位參與放射抗性的形成;2 EMT參與NRAGE亞細胞定位從而促進放射抗性的形成。
【關(guān)鍵詞】：食管鱗狀細胞癌 放射抗性 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 NRAGE TGF-β1
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.1
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-10
• 英文縮寫10-11
• 前言11-12
• 材料與方法12-23
• 結(jié)果23-26
• 附圖26-29
• 附表29-31
• 討論31-33
• 結(jié)論33-34
• 參考文獻34-37
• 綜述EMT參與放射抗性形成的分子機制37-43
• 參考文獻40-43
• 致謝43-44
• 個人簡歷44

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