本文關(guān)鍵詞：Icotinib耐藥NSCLC細(xì)胞株的建立及其耐藥機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 非小細(xì)胞肺癌 EGFR �？颂婺� 耐藥 代謝組學(xué) 谷氨酸 c-Met

【摘要】：目的：近年來,隨著腫瘤個(gè)體化靶向治療的迅速發(fā)展,以吉非替尼(Gefitinib)和厄洛替尼(Erlotinib)為代表的表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKI)在EGFR陽性突變的晚期非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者中療效顯著。但隨著用藥時(shí)間的延長(12-14個(gè)月),患者最終對其產(chǎn)生耐藥性,病情復(fù)發(fā)或進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn),EGFR-TKI潛在的耐藥機(jī)制是復(fù)雜和多樣的,涉及靶蛋白的改變或EGFR的T790M繼發(fā)突變、EGFR下游通路中PI3K、KRAS、BRAF等基因突變、c-Met擴(kuò)增或HGF過表達(dá)、發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)和向小細(xì)胞類型轉(zhuǎn)化(small cell lung cancer, SCLC)等,但是還有20-30%的耐藥機(jī)制不明確,可能與表觀遺傳學(xué)、代謝異常等有關(guān)。腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展都會(huì)產(chǎn)生大量的代謝物變化,所以腫瘤也是一種代謝性疾病。利用代謝組學(xué)的方法尋找親本細(xì)胞和耐藥細(xì)胞之間差異的代謝物,有助于了解耐藥發(fā)生的機(jī)制,尋找新的潛在藥物靶點(diǎn)。方法：本研究中我們選用三種不同的NSCLC細(xì)胞株A549 (EGFR野生型)、PC-9 (EGFR敏感突變型)和H1975 (EGFR T790M繼發(fā)突變型),DNA直接測序法檢測A549、PC-9和H1975的EGFR突變狀態(tài)；采用國產(chǎn)的EGFR- TKI (�？颂婺�,icotinib)在體外以小劑量濃度梯度遞增法誘導(dǎo)建立�？颂婺崮退幹闍549/IR、PC-9/IR和H1975/IR。從不同角度對耐藥株進(jìn)行鑒定：3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽法(3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,MTT)檢測PC-9/IR的耐藥性及耐藥穩(wěn)定性;光鏡下觀察其形態(tài)學(xué)變化；DNA測序法檢測EGFR的T790M狀態(tài);應(yīng)用Real-time PCR和Western blot檢測EGFR及其旁路信號(hào)相關(guān)分子的表達(dá)：小鼠移植瘤模型檢測PC-9/IR耐藥細(xì)胞在體內(nèi)的增殖能力。分別收集親本細(xì)胞和耐藥細(xì)胞利用核磁共振分析技術(shù)手段分析親本細(xì)胞和耐藥細(xì)胞的差異代謝物,通過主成分分析(principal component analysis, PCA)和偏最小二乘法-判別分析(partial least squares discriminant analysis, PLS-DA)分析得出載荷圖和VIP (variable importance in projection, VIP)圖,找到區(qū)分親本細(xì)胞和耐藥細(xì)胞貢獻(xiàn)最大的代謝物。通過對差異代謝物代謝通路的分析推測可能的藥物作用靶點(diǎn),并檢測針對此靶點(diǎn)的抑制劑對PC-9/IR耐藥細(xì)胞生長和增殖的影響,以及與此靶點(diǎn)相關(guān)的蛋白質(zhì)在PC-9/IR耐藥細(xì)胞中的表達(dá)情況。結(jié)果：歷時(shí)近8個(gè)月獲得�？颂婺崮退幹闍549/IR (A549/Icotinib resistant)和H1975/IR,近6個(gè)月獲得PC-9/IR耐藥細(xì)胞。MTT法檢測到A549/IR、H1975/IR和PC-9/IR對�？颂婺崮退�,且PC-9/IR耐藥細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(50% inhibiting concentration, IC50)是21.49μmol/L,高于PC-9親本細(xì)胞的IC50值1.32μmol/L,達(dá)到高度耐藥狀態(tài)；A549/IR耐藥細(xì)胞的IC50為173.73μmol/L,高于A549親本細(xì)胞的IC50值17.46μmol/L;H1975/IR耐藥細(xì)胞的IC50為196.73μmol/L,高于H1975親本細(xì)胞的IC50值23.93μmol/L。對PC-9/IR耐藥的穩(wěn)定性檢測發(fā)現(xiàn)在2μmol/L埃克替尼中持續(xù)培養(yǎng)PC-9/IR 4個(gè)月,其耐藥性依然穩(wěn)定；PC-9/IR耐藥細(xì)胞未發(fā)生T790M繼發(fā)突變。PC-9/IR耐藥細(xì)胞中EGFR、PI3K、AKT、STAT3和c-Met的表達(dá)水平較親本株高,分別為12.09、5.73、3.72、7.44和5.31倍；�？颂婺岵荒芤种芇C-9/IR耐藥細(xì)胞中AKT和STAT3的活化且多藥耐藥蛋白ABCG2(ATP-binding cassette superfamily G member 2, ABCG2)在PC-9/IR耐藥細(xì)胞中表達(dá)量升高：結(jié)合c-Met及下游分子在PC-9/IR耐藥細(xì)胞中表達(dá)升高且利用c-Met抑制劑(克唑替尼,crizotinib)可以抑制PC-9/IR耐藥細(xì)胞體外、體內(nèi)的增殖,提示PC-9/IR耐藥細(xì)胞發(fā)生了c-Met旁路活化。核磁共振分析技術(shù)得到A549/IR、H1975/IR、PC-9/IR和A549、PC-9、H1975的代謝指紋圖譜,分析6大類包括氨基酸及衍生物、有機(jī)酸類、糖類、醇類、核苷酸組分等共62種代謝物的濃度。運(yùn)用PCA主成分分析和PLS-DA多元統(tǒng)計(jì)分析得到親本細(xì)胞和耐藥細(xì)胞代謝輪廓相異,并分別得出VIP值大于1的15種區(qū)分親本細(xì)胞和耐藥細(xì)胞代謝差異的代謝物。三種不同EGFR狀態(tài)的細(xì)胞系,篩選得到的區(qū)分親本細(xì)胞和耐藥細(xì)胞的差異代謝物不完全相同：區(qū)分PC-9細(xì)胞和PC-9/IR耐藥細(xì)胞的標(biāo)志差異代謝物是谷氨酸,醋酸鹽、尿酸、膽堿和丙氨酸；區(qū)分A549和A549/IR細(xì)胞的差異代謝物是谷氨酸、谷氨酰胺、乳酸、天冬氨酸和谷胱甘肽;區(qū)分H1975細(xì)胞和H1975/IR耐藥細(xì)胞的差異代謝物是乳酸、谷氨酸、�；撬�、醋酸鹽和脯氨酸。PC-9/IR耐藥細(xì)胞的生長對谷氨酰胺存在濃度依賴性,促進(jìn)谷氨酰胺酶表達(dá)的c-Myc基因在PC-9/IR耐藥細(xì)胞中表達(dá)升高且�？颂婺岵荒芤种芻-Myc在PC-9/IR耐藥細(xì)胞中表達(dá)。谷氨酰胺酶抑制劑Compound 968可以抑制PC-9/IR耐藥細(xì)胞在體外的增殖。結(jié)論：成功建立了A549/IR、H1975/IR和PC-9/IR三株耐藥細(xì)胞。研究結(jié)果提示PC-9/IR的耐藥與c-Met活化、ABCG2表達(dá)升高及代謝變化有關(guān)。谷氨酰胺代謝通路是潛在的藥物靶點(diǎn),初步的研究結(jié)果提示谷氨酰胺酶抑制劑可以抑制PC-9/IR的增殖且存在劑量依賴性。
【關(guān)鍵詞】：非小細(xì)胞肺癌 EGFR �？颂婺� 耐藥 代謝組學(xué) 谷氨酸 c-Met
【學(xué)位授予單位】：北京交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R734.2
【目錄】：

• 致謝5-6
• 摘要6-9
• ABSTRACT9-15
• 1 背景介紹15-29
• 1.1 前言15
• 1.2 EGFR的結(jié)構(gòu)和功能15-16
• 1.3 EGFR突變狀態(tài)和EGFR-TKI的作用機(jī)制16-17
• 1.4 EGFR-TKI的耐藥機(jī)制17-22
• 1.4.1 原發(fā)性耐藥機(jī)制17-18
• 1.4.2 獲得性耐藥機(jī)制18-22
• 1.5 腫瘤與代謝22-26
• 1.5.1 “Warburg效應(yīng)”學(xué)說22-23
• 1.5.2 腫瘤細(xì)胞代謝特點(diǎn)—有氧糖酵解23-24
• 1.5.3 腫瘤細(xì)胞代謝另一特點(diǎn)—消耗大量谷氨酰胺24-25
• 1.5.4 抑制能量代謝殺滅腫瘤細(xì)胞25-26
• 1.6 代謝組學(xué)及其應(yīng)用26-27
• 1.7 本研究目的和意義27-29
• 2 實(shí)驗(yàn)材料29-35
• 2.1 細(xì)胞系29
• 2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物29
• 2.3 藥品29
• 2.4 主要試劑29-30
• 2.5 主要儀器設(shè)備30-31
• 2.6 主要緩沖液配制31-35
• 3 實(shí)驗(yàn)方法35-51
• 3.1 細(xì)胞培養(yǎng)35
• 3.2 EGFR突變狀態(tài)的檢測35-38
• 3.2.1 細(xì)胞中基因組DNA提取36
• 3.2.2 DNA定量36
• 3.2.3 PCR擴(kuò)增36-38
• 3.2.4 瓊脂糖凝膠電泳檢測38
• 3.2.5 測序38
• 3.3 耐藥細(xì)胞株的建立38-40
• 3.3.1 MTT法檢測�？颂婺釋�(xì)胞活性的影響38-39
• 3.3.2 �？颂婺釋�(xì)胞克隆形成能力的檢測39
• 3.3.3 檢測�？颂婺釋�(xì)胞凋亡的影響39
• 3.3.4 耐藥細(xì)胞株的誘導(dǎo)39-40
• 3.4 耐藥細(xì)胞株的鑒定40-47
• 3.4.1 耐藥細(xì)胞株耐藥指數(shù)的測定40
• 3.4.2 耐藥穩(wěn)定性的檢測40
• 3.4.3 耐藥細(xì)胞株形態(tài)學(xué)的觀察40
• 3.4.4 EGFR T790M突變狀態(tài)檢測40-41
• 3.4.5 Real-time PCR檢測EGFR及其旁路信號(hào)相關(guān)分子表達(dá)41-43
• 3.4.6 Western blot檢測EGFR及其旁路信號(hào)相關(guān)分子磷酸化及總蛋白表達(dá)43-46
• 3.4.7 PC-9/IR耐藥細(xì)胞株皮下移植瘤模型的建立46-47
• 3.5 不同細(xì)胞株代謝差異物的分析47-49
• 3.5.1 樣本收集47
• 3.5.2 樣本制備47-48
• 3.5.3 采集核磁數(shù)據(jù)參數(shù)48-49
• 3.5.4 核磁數(shù)據(jù)處理49
• 3.6 谷氨酰胺酶抑制劑對PC-9/IR耐藥細(xì)胞的影響49-50
• 3.6.1 谷氨酰胺對PC-9/IR耐藥細(xì)胞的影響49-50
• 3.6.2 Western Blot檢測PC-9/IR耐藥細(xì)胞中谷氨酰胺相關(guān)蛋白表達(dá)50
• 3.6.3 Compound 968與�？颂婺崧�(lián)用對PC-9/IR耐藥細(xì)胞的影響50
• 3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理50-51
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果51-79
• 4.1 A549,H1975和PC-9細(xì)胞EGFR突變狀態(tài)的檢測51-52
• 4.1.1 EGFR18、19、20、21外顯子PCR擴(kuò)增51
• 4.1.2 直接測序法-檢測EGFR基因突變的結(jié)果51-52
• 4.2 耐藥細(xì)胞株的建立52-56
• 4.2.1 �？颂婺釋Σ煌珽GFR突變狀態(tài)細(xì)胞生長的影響52-53
• 4.2.2 �？颂婺釋C-9細(xì)胞克隆能力形成的影響53-54
• 4.2.3 �？颂婺釋C-9細(xì)胞凋亡的影響54-56
• 4.3 耐藥細(xì)胞株的鑒定56-61
• 4.3.1 MTT法測耐藥細(xì)胞的耐藥性56-57
• 4.3.2 耐藥細(xì)胞株穩(wěn)定性的測定57
• 4.3.3 耐藥細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察57-58
• 4.3.4 EGFR T790M突變檢測58-59
• 4.3.5c-Met過表達(dá)的檢測59-60
• 4.3.6 PC-9/IR耐藥株小鼠移植瘤模型的建立及其體外、內(nèi)增殖能力的檢測60-61
• 4.4 NMR檢測親本細(xì)胞和耐藥細(xì)胞代謝物差異61-74
• 4.4.1 代謝輪廓?dú)w屬譜圖61-62
• 4.4.2 代謝物種類與濃度62-65
• 4.4.3 多變量統(tǒng)計(jì)學(xué)分析65-74
• 4.5 PC-9/IR耐藥細(xì)胞生長對谷氨酰胺存在依賴性74-79
• 4.5.1 谷氨酰胺酶抑制劑抑制PC-9/IR耐藥細(xì)胞的增殖74-76
• 4.5.2 C-MYC在PC-9/IR耐藥細(xì)胞中的表達(dá)情況76-79
• 5 討論79-83
• 6 結(jié)論83-85
• 參考文獻(xiàn)85-91
• 附錄 A91-93
• 作者簡歷及攻讀碩士學(xué)位期間取得的研究成果93-97
• 學(xué)位論文數(shù)據(jù)集97

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本文編號(hào)：941420