本文關(guān)鍵詞：金屬配合物的合成及其與人血清白蛋白相互作用的抗腫瘤活性的研究

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【摘要】：本文合成了兩類金屬配合物。第一類金屬配合物是以希夫堿縮氨基硫脲為配體的銅金屬配合物。第二類金屬配合物是以白花丹素為配體,合成了兩個(gè)還沒有見報(bào)道的銅金屬配合物。我們利用元素分析、紅外光譜、質(zhì)譜以及單晶x-射線衍射分析等技術(shù)對這些金屬配合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征鑒定。在細(xì)胞水平上,利用MTT法、流式細(xì)胞儀檢測法和熒光拍照等手段對這些金屬配合物進(jìn)行體外抗腫瘤活性的檢測,以及其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究。在分子水平上,利用蛋白免疫印記技術(shù)(Western Blot)檢測這些金屬配合物對凋亡相關(guān)蛋白以及周期相關(guān)蛋白表達(dá)情況的影響。本論文研究內(nèi)容主要為以下幾點(diǎn)：1.簡要介紹腫瘤現(xiàn)狀和抗癌藥物的一些概況：概述了希夫堿縮氨基硫脲及其金屬配合物的生物活性的研究進(jìn)展；對人血清白蛋白(HSA)作為藥物載體靶向治療腫瘤的研究做了簡單的介紹,并在此基礎(chǔ)上簡要的闡述了本論文的選題依據(jù)以及意義。2.銅(Ⅱ)配合物被認(rèn)為是作為下一代金屬抗癌藥物的一個(gè)很有前景的候選藥物,并被廣泛研究。因此,本章合成了四個(gè)由希夫堿縮氨基硫脲(L1-L4)為配體的雙核銅(Ⅱ)配合物,即[CuCl(L 1)]2 (C1), [CuNO_3(L2)]2 (C2), [Cu(NCS)(L3)]2 (C3)和[Cu(CH_3COO)(L4)]2 (C4)。用x-射線晶體衍射分析解析這四種配合物的晶體結(jié)構(gòu)。通過MTT法、熒光顯微鏡觀察拍照法、流式細(xì)胞儀檢測法以及Western Blot研究了C1-C4配合物和C4-HSA復(fù)合物的抗腫瘤活性和作用機(jī)制。研究結(jié)果如下：(1)MTT法檢測到Cu(Ⅱ)離子和配體(HL)對BEL-7404、A549、NCI-H460這幾種癌細(xì)胞的作用效果并不好,但是C1-C4配合物對癌細(xì)胞具有較高的細(xì)胞毒性。比較配合物C1-C4,發(fā)現(xiàn)C4配合物的細(xì)胞毒性最強(qiáng),而C1配合物的細(xì)胞毒性最弱。C4配合物是C2和C3配合物的兩倍,而C2和C3配合物又是C1配合物毒性的兩倍。C4配合物對上述三種癌細(xì)胞的ICso依次為0.486土0.010、0.507士0.021、0.235士0.010μm,當(dāng)然,一旦它們與人血清白蛋白相互作用后,對腫瘤細(xì)胞的毒性會(huì)提高,相應(yīng)的IC50會(huì)降低。(2)以人肝癌細(xì)胞BEL-7404為代表,我們研究了C1-C4配合物和C4-HSA復(fù)合物對腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制。本章利用吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)熒光染色法和FITC Annexin V/PI雙染檢測法,表明上述配合物可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。利用JC-1染色實(shí)驗(yàn)、活性氧(ROS)檢測實(shí)驗(yàn)、GSH/GSSG檢測實(shí)驗(yàn)對C1-C4配合物以及C4-HSA復(fù)合物誘導(dǎo)BEL-7404細(xì)胞凋亡機(jī)制進(jìn)行了研究。JC-1染色結(jié)果表明,上述幾種物質(zhì)刺激BEL-7404細(xì)胞后,用JC-1染色,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞逐漸由發(fā)紅色熒光轉(zhuǎn)變?yōu)榘l(fā)綠色熒光,表明線粒體膜電位降低,說明癌細(xì)胞發(fā)生了凋亡。ROS和GSH/GSSG實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,相對于空白對照組而言,這幾種物質(zhì)使得細(xì)胞內(nèi)ROS的水平提高了,GSH/GSSG的比值降低了,其中C1-C4這四種配合物中,C4配合物ROS水平最高,GSH/GSSG的比值最低,而C1配合物ROS水平提高得最小、GSH/GSSG的比值最大,這可能與這四種配合物上所帶的官能團(tuán)有關(guān)。 (3)采用Western Blot檢測了C1-C4配合物以及C4與HSA相互作用后對BEL-7404細(xì)胞中的Bcl-2家族中的抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白以及caspase-9、caspase-3蛋白表達(dá)的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl的表達(dá)下調(diào)了,而促凋亡蛋白Bax的表達(dá)上調(diào),導(dǎo)致Bax/Bcl-2的比值變大了,促使腫瘤細(xì)胞更容易發(fā)生凋1L=。此外,細(xì)胞色素C(Cyt-c)的釋放促進(jìn)了caspase家族蛋白的級聯(lián)反應(yīng)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了C1-C4配合物以及C4配合物和HSA相互作用后對細(xì)胞的抗腫瘤活性的機(jī)制是通過內(nèi)源性線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑。3.以天然白花丹素為配體(PLN)合成了四個(gè)銅(Ⅱ)金屬配合物,它們依次為[Cu(PLN)2]·2H_2O(C1); [Cu(PLN)(bipy)(H_2O)]NO_3·2H_2O(C2) [Cu(PLN)(Phen)]NO_3·0.25H_2O (C3); [Cu(PLN)(Phen)(Br)]CH_3OH (C4)。采用元素分析、紅外光譜、質(zhì)譜以及單晶x-射線衍射分析等技術(shù)對這些銅金屬配合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征鑒定,發(fā)現(xiàn)這四種銅金屬配合物(C1、C2、C3、C4)都是單核配合物。這些銅(Ⅱ)金屬配合物結(jié)構(gòu)的確定為后續(xù)的金屬基藥物抗腫瘤生物活性和作用機(jī)制的研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)和保障。葉酸(FA)修飾的HSA載體(FA-HSA)有望改善抗腫瘤藥物的靶向性與藥效。為了開發(fā)金屬抗腫瘤藥物的FA-HSA載體,我們研究了FA-HSA作為由天然白花丹素為配體衍生的銅(Ⅱ)金屬配合物的載體的抗腫瘤活性和機(jī)制。熒光光譜和分子對接表明,Cu(Ⅱ)金屬配合物結(jié)合到HSA的ⅡA亞結(jié)構(gòu)域上。利用MTT法研究了這四個(gè)銅金屬配合物在有無FA-HSA載體的條件下對人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)和人宮頸癌細(xì)胞(HeLa)這兩種腫瘤細(xì)胞以及正常細(xì)胞的細(xì)胞毒性,結(jié)果表明,與單獨(dú)的銅(Ⅱ)金屬配合物作用于腫瘤細(xì)胞相比,在某種程度上,通過選擇性的在腫瘤細(xì)胞中積累葉酸-人血清白蛋白-金屬藥物復(fù)合物,從而增強(qiáng)該復(fù)合物對葉酸陽性的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性,但是沒有提高對在體外的正常細(xì)胞(WI-38)的細(xì)胞毒性：利用流式細(xì)胞儀檢測法,檢測裸藥C3和該裸藥與載體的復(fù)合物,即葉酸-人血清白蛋白-金屬藥物復(fù)合物對HeLa周期的影響,結(jié)果顯示,葉酸-人血清白蛋白-金屬藥物復(fù)合物對HeLa的G2/M期的細(xì)胞周期阻滯能力更強(qiáng),并下調(diào)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1(CDK1)和細(xì)胞周期蛋白B1的表達(dá)水平。此外,葉酸-人血清白蛋白-金屬藥物復(fù)合物通過線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性活性氧途徑,并伴隨著Bcl-2家族蛋白的調(diào)控來促進(jìn)HeLa的凋亡。本文主要研究了兩類金屬配合物,我們的研究可能為未來開發(fā)新型抗癌金屬配合物提供實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)以及通過合理設(shè)計(jì)人血清白蛋白載體開發(fā)金屬抗癌藥物的靶向性治療。
【關(guān)鍵詞】：人血清白蛋白 載體 抗腫瘤活性 周期 凋亡
【學(xué)位授予單位】：廣西師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R73-36
【目錄】：

• 摘要3-6
• Abstract6-11
• 第1章 前言11-17
• 1.1 引言11-12
• 1.2 縮氨基硫脲金屬配合物抗腫瘤生物活性的研究概況12
• 1.3 銅以及銅金屬配合物生物活性的研究12-13
• 1.4 人血清白蛋白作為藥物載體的概述13-14
• 1.5 線粒體與細(xì)胞凋亡14-15
• 1.6 論文的選題依據(jù)及研究內(nèi)容15-17
• 第2章 氨基硫脲希夫堿銅金屬配合物的合成及其與人血清白蛋白相互作用的抗腫瘤活性與作用機(jī)制的研究17-40
• 2.1 引言17-18
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料18-19
• 2.2.1 主要儀器18
• 2.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑18-19
• 2.2.3 細(xì)胞株19
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法19-30
• 2.3.1 金屬配合物的合成和表征19-24
• 2.3.2 配合物對腫瘤細(xì)胞活性的初篩24-25
• 2.3.3 細(xì)胞調(diào)亡實(shí)驗(yàn)25-26
• 2.3.4 細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的檢測26
• 2.3.5 細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)的檢測26-27
• 2.3.6 Western blot檢測27-30
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論30-39
• 2.4.1 配合物對腫瘤細(xì)胞的抑制率及IC_(50)值的測定30-32
• 2.4.2 細(xì)胞調(diào)亡分析32-35
• 2.4.3 細(xì)胞內(nèi)活性氧的檢測35-36
• 2.4.4 GSH/GSSG的檢測36-37
• 2.4.5 蛋白質(zhì)印記實(shí)驗(yàn)檢測腫瘤細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)水平37-39
• 2.5 本章小結(jié)39-40
• 第3章 葉酸官能化的人血清白蛋白作為由天然白花丹素衍生的抗癌銅(Ⅱ)復(fù)合物載體的抗腫瘤活性的研究40-65
• 3.1 引言40-41
• 3.2 實(shí)驗(yàn)部分41-51
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑41
• 3.2.2 四個(gè)由天然白花丹素衍生的銅配合物的合成41-42
• 3.2.3 銅(Ⅱ)配合物的晶體結(jié)構(gòu)測定42-44
• 3.2.4 葉酸-人血清白蛋白的合成44
• 3.2.5 葉酸-人血清白蛋白對Cu(Ⅱ)化合物的結(jié)合性質(zhì)44-45
• 3.2.6 銅(Ⅱ)配合物抗癌活性45-46
• 3.2.7 銅(Ⅱ)配合物的抗癌機(jī)制46-50
• 3.2.8 葉酸-人血清白蛋白-金屬藥物配合物的靶向性50-51
• 3.3 結(jié)果和討論51-63
• 3.3.1 葉酸-人血清白蛋白載體的表征51
• 3.3.2 由白花丹素衍生而來的兩個(gè)Cu(Ⅱ)配合物的結(jié)構(gòu)表征51-53
• 3.3.3 銅(Ⅱ)配合物在溶液中的狀態(tài)53
• 3.3.4 銅配合物對葉酸-人血清白蛋白的結(jié)合53-56
• 3.3.5 葉酸-人血清白蛋白-金屬藥物配合物的抗腫癌活性56-58
• 3.3.6 葉酸-人血清白蛋白-金屬藥物復(fù)合物可能的抗癌機(jī)制58-63
• 3.3.7 葉酸-人血清白蛋白-金屬藥物復(fù)合物的靶向性63
• 3.4 本章小結(jié)63-65
• 第4章 總結(jié)與展望65-67
• 參考文獻(xiàn)67-83
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表論文情況83-84
• 致謝84-85

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1 楊峰;梁宏;;人血清白蛋白及其復(fù)合物的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[J];化學(xué)進(jìn)展;2013年04期

2 葉劍雄,紀(jì)曉峰,王薇薇,何巋,葛忠良,郝崇;重組人血清白蛋白的表達(dá)[J];上海醫(yī)藥;2000年11期

3 李玉珍,劉學(xué)涌,陳曉凱,常昆;兩親磁性高分子微球與人血清白蛋白的相互作用[J];中國藥學(xué)雜志;2004年09期

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本文編號：935242