本文關鍵詞：CREB在腦膠質(zhì)瘤中的表達及敲除后對腫瘤細胞生物學特性的影響

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【摘要】：目的:探討環(huán)磷腺苷效應元件結合蛋白(CREB)在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達情況,以及應用CRISPR/Cas9技術敲除CREB后對人腦膠質(zhì)瘤細胞系U251增值、遷移、侵襲、凋亡及體外成瘤的影響方法:一、組織檢測1)采集術后不同級別的人腦膠質(zhì)瘤標本,并收集正常顱腦外傷減壓術后的腦組織作為空白對照,采用免疫組化法、RT-PCR、Western blot檢測腫瘤標本CREB的表達情況。二、細胞檢測1)建立穩(wěn)定敲除的細胞系:采用CRISPR/Cas9技術敲除膠質(zhì)瘤U251細胞系中的CREB基因,并建立穩(wěn)定敲除的細胞株;并通過Cruiser?酶切篩選陽性KO克隆、Western blot檢測敲除后的U251細胞系中CREB的表達情況;2)CRISPR/Cas9敲除CREB后對腫瘤細胞增殖的影響:采用CCK-8法檢測通過CRISPR/Cas9敲除后的U251細胞株細胞增殖速度的改變并Western blot檢測Cyclin D1的蛋白表達情況。3)CRISPR/Cas9敲除CREB后對腫瘤細胞遷移、侵襲的影響:采用Transwell小室檢測敲低CREB前后U251細胞株遷移、侵襲能力的改變并Western blot檢測E-cadherin的蛋白表達情況。4)CRISPR/Cas9敲除CREB后對腫瘤細胞凋亡的影響,并探究敲除后對ERK-CREB、PI3激酶/Akt-CREB兩條重要的磷酸化信號通路影響,采用Western blot檢測bcl-2、bax、p ERK、p Akt的蛋白表達情況。三、裸鼠檢測1)U251細胞系裸鼠成瘤檢測:BALB/C-nu裸鼠作為動物研究模型,將裸鼠隨機分組,分別收集U251、U251-NT及U251-KO細胞進行皮下注射,繪制各組動物皮下移植瘤生長曲線,并對活體腫瘤標本中CREB的表達進行Western blot檢測分析。結果:1)CREB在不同分化程度腦膠質(zhì)瘤組織中均存在過表達現(xiàn)象,且不同級別膠質(zhì)瘤中表達量有統(tǒng)計學意義(P0.05),與腫瘤的分化程度呈正相關(P0.05)2)CRISPR/Cas9敲除后的U251穩(wěn)定細胞株中CREB的m RNA以及蛋白含量明顯降低(P0.05)。3)CRISPR/Cas9敲除后的U251穩(wěn)定細胞株增殖、遷移以及侵襲能力明顯降低,細胞凋亡增加,其磷酸化信號通路相關蛋白表達量也有明顯變化,以上指標與對照組相比,均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。4)CRISPR/Cas9敲除后的U251穩(wěn)定細胞株在裸鼠的成瘤能力與對照組相比,明顯下降。結論:CREB在不同分化程度腦膠質(zhì)瘤組織中均存在過表達現(xiàn)象,與腫瘤的分化程度呈正相關。在CRISPR/Cas9穩(wěn)定敲除后的U251穩(wěn)定膠質(zhì)瘤細胞株中,細胞的增殖、遷移、侵襲以及裸鼠成瘤能力均下降,凋亡水平增加,因此我們推測CREB可能在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。
【關鍵詞】：CREB CRISPR/Cas9 膠質(zhì)瘤
【學位授予單位】：河北大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R739.41
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-10
• 前言10-12
• 第一章 CREB在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達及臨床意義12-17
• 1 資料與方法12-14
• 1.1 標本資料12-13
• 1.2 方法13-14
• 1.3 統(tǒng)計學方法14
• 2 結果14-17
• 2.1 免疫組化檢測CREB在膠質(zhì)瘤組織中的表達14-16
• 2.2 RT-PCR、Western blot檢測CREB在組織中的表達16-17
• 第二章 CRISPR/Cas9介導的目的基因敲除17-22
• 1 材料與方法17-19
• 1.1 試驗材料17
• 1.2 主要儀器17
• 1.3 試驗方法17-19
• 2 實驗結果19-21
• 2.1 實驗參數(shù)19
• 2.2 結果檢測19-21
• 3 結論21-22
• 第三章 CRISPR/Cas9特異性敲除CREB對膠質(zhì)瘤U251細胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響22-27
• 3.1 材料與方法22-23
• 3.2 結果23-26
• 3.3 結論26-27
• 第四章 CRISPR/Cas9特異性敲除CREB的U251細胞在裸鼠體內(nèi)成瘤能力的影響27-34
• 4.1 實驗材料27
• 4.2 實驗方法27-28
• 4.3 實驗結果28-29
• 4.4 討論（一至四章）29-34
• 第五章 結論34-35
• 參考文獻35-37
• 綜述37-46
• 參考文獻44-46
• 致謝46-47
• 研究生期間所發(fā)表文章47

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本文編號：931455