本文關(guān)鍵詞：CREB在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及敲除后對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的影響

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【摘要】：目的:探討環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)情況,以及應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除CREB后對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251增值、遷移、侵襲、凋亡及體外成瘤的影響方法:一、組織檢測(cè)1)采集術(shù)后不同級(jí)別的人腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本,并收集正常顱腦外傷減壓術(shù)后的腦組織作為空白對(duì)照,采用免疫組化法、RT-PCR、Western blot檢測(cè)腫瘤標(biāo)本CREB的表達(dá)情況。二、細(xì)胞檢測(cè)1)建立穩(wěn)定敲除的細(xì)胞系:采用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞系中的CREB基因,并建立穩(wěn)定敲除的細(xì)胞株;并通過Cruiser?酶切篩選陽(yáng)性KO克隆、Western blot檢測(cè)敲除后的U251細(xì)胞系中CREB的表達(dá)情況;2)CRISPR/Cas9敲除CREB后對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響:采用CCK-8法檢測(cè)通過CRISPR/Cas9敲除后的U251細(xì)胞株細(xì)胞增殖速度的改變并Western blot檢測(cè)Cyclin D1的蛋白表達(dá)情況。3)CRISPR/Cas9敲除CREB后對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲的影響:采用Transwell小室檢測(cè)敲低CREB前后U251細(xì)胞株遷移、侵襲能力的改變并Western blot檢測(cè)E-cadherin的蛋白表達(dá)情況。4)CRISPR/Cas9敲除CREB后對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響,并探究敲除后對(duì)ERK-CREB、PI3激酶/Akt-CREB兩條重要的磷酸化信號(hào)通路影響,采用Western blot檢測(cè)bcl-2、bax、p ERK、p Akt的蛋白表達(dá)情況。三、裸鼠檢測(cè)1)U251細(xì)胞系裸鼠成瘤檢測(cè):BALB/C-nu裸鼠作為動(dòng)物研究模型,將裸鼠隨機(jī)分組,分別收集U251、U251-NT及U251-KO細(xì)胞進(jìn)行皮下注射,繪制各組動(dòng)物皮下移植瘤生長(zhǎng)曲線,并對(duì)活體腫瘤標(biāo)本中CREB的表達(dá)進(jìn)行Western blot檢測(cè)分析。結(jié)果:1)CREB在不同分化程度腦膠質(zhì)瘤組織中均存在過表達(dá)現(xiàn)象,且不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中表達(dá)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),與腫瘤的分化程度呈正相關(guān)(P0.05)2)CRISPR/Cas9敲除后的U251穩(wěn)定細(xì)胞株中CREB的m RNA以及蛋白含量明顯降低(P0.05)。3)CRISPR/Cas9敲除后的U251穩(wěn)定細(xì)胞株增殖、遷移以及侵襲能力明顯降低,細(xì)胞凋亡增加,其磷酸化信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)量也有明顯變化,以上指標(biāo)與對(duì)照組相比,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4)CRISPR/Cas9敲除后的U251穩(wěn)定細(xì)胞株在裸鼠的成瘤能力與對(duì)照組相比,明顯下降。結(jié)論:CREB在不同分化程度腦膠質(zhì)瘤組織中均存在過表達(dá)現(xiàn)象,與腫瘤的分化程度呈正相關(guān)。在CRISPR/Cas9穩(wěn)定敲除后的U251穩(wěn)定膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中,細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲以及裸鼠成瘤能力均下降,凋亡水平增加,因此我們推測(cè)CREB可能在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。
【關(guān)鍵詞】：CREB CRISPR/Cas9 膠質(zhì)瘤
【學(xué)位授予單位】：河北大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R739.41
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-10
• 前言10-12
• 第一章 CREB在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及臨床意義12-17
• 1 資料與方法12-14
• 1.1 標(biāo)本資料12-13
• 1.2 方法13-14
• 1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法14
• 2 結(jié)果14-17
• 2.1 免疫組化檢測(cè)CREB在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)14-16
• 2.2 RT-PCR、Western blot檢測(cè)CREB在組織中的表達(dá)16-17
• 第二章 CRISPR/Cas9介導(dǎo)的目的基因敲除17-22
• 1 材料與方法17-19
• 1.1 試驗(yàn)材料17
• 1.2 主要儀器17
• 1.3 試驗(yàn)方法17-19
• 2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果19-21
• 2.1 實(shí)驗(yàn)參數(shù)19
• 2.2 結(jié)果檢測(cè)19-21
• 3 結(jié)論21-22
• 第三章 CRISPR/Cas9特異性敲除CREB對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響22-27
• 3.1 材料與方法22-23
• 3.2 結(jié)果23-26
• 3.3 結(jié)論26-27
• 第四章 CRISPR/Cas9特異性敲除CREB的U251細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)成瘤能力的影響27-34
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料27
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法27-28
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果28-29
• 4.4 討論（一至四章）29-34
• 第五章 結(jié)論34-35
• 參考文獻(xiàn)35-37
• 綜述37-46
• 參考文獻(xiàn)44-46
• 致謝46-47
• 研究生期間所發(fā)表文章47

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本文編號(hào)：931455