本文關(guān)鍵詞：CRIM1促進非小細胞肺癌粘附與遷移的功能研究

  更多相關(guān)文章： 富半胱氨酸運動神經(jīng)元蛋白1 轉(zhuǎn)化生長因子β1 上皮間質(zhì)化 E-鈣粘素 N-鈣粘素

【摘要】：富含半胱氨酸型運動神經(jīng)元蛋白1(CRIM1)是一類富含半胱氨酸的跨膜蛋白,該蛋白是新發(fā)現(xiàn)的拮抗BMPs蛋白家族的一個成員,早前對于CRIM1的研究主要是在于胚胎和器官發(fā)育以及腎纖維化疾病當(dāng)中�；谄湓缜皥蟮赖墓δ�,我們推測該蛋白可能在癌細胞的粘附和遷移行為當(dāng)中有著重要的作用,并可能進一步影響到癌細胞的表皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化行為。本文的主要研究內(nèi)容:檢測在不同轉(zhuǎn)染條件下si RNA轉(zhuǎn)染后的沉默效率,通過q PCR,westernblot檢測CRIM1的基因和蛋白的表達量,進而篩選出最適si RNA轉(zhuǎn)染條件。結(jié)果顯示,在轉(zhuǎn)染后48h,轉(zhuǎn)染試劑與si RNA體積比在1:1的情況下,A549中CRIM1的表達水平下調(diào)達到最佳。通過si RNA轉(zhuǎn)染抑制CRIM1表達表達和加入CRIM1多肽誘導(dǎo)處理兩種方式對A549細胞進行處理,用MTT法分析CRIM1對A549細胞增殖能力的影響,結(jié)果顯示CRIM1對A549細胞增殖能力無明顯影響;通過傷痕愈合法分析CRIM1對A549細胞遷移能力的影響,結(jié)果顯示CRIM1對A549細胞遷移能力為正調(diào)控;通過粘附分析法分析CRIM1對A549細胞粘附能力的影響,結(jié)果顯示CRIM1對A549細胞粘附能力為正調(diào)控。得出結(jié)論:CRIM1對A549細胞的遷移和粘附呈正調(diào)控,而對其增殖無顯著影響。鑒于CRIM1可以影響細胞的粘附和遷移行為,因此我們懷疑該蛋白參與細胞EMT。先用TGFβ1誘導(dǎo)A549細胞發(fā)生EMT后,通過進一步實驗分析CRIM1是否參與到A549細胞EMT的過程當(dāng)中。結(jié)果顯示CRIM1在EMT過程中呈現(xiàn)蛋白上調(diào),但CRIM1多肽誘導(dǎo)并不能使細胞發(fā)生EMT。此外,CRIM1的加入也無法誘導(dǎo)和逆轉(zhuǎn)EMT的發(fā)生。CRIM1沉默后蛋白表達結(jié)果顯示CRIM1的沉默可以使N-CAD,E-CAD的蛋白表上調(diào)。得出結(jié)論:CRIM1不能直接誘導(dǎo)細胞發(fā)生EMT,它可能并不直接參與到EMT的過程當(dāng)中,但是CRIM1的沉默對于N-CAD,E-CAD蛋白的表達有影響。我們構(gòu)建了原癌基因YAP1真核表達質(zhì)粒pc DNA3.1(+)-EGFP-YAP1,并將其轉(zhuǎn)染到A549細胞以過表達Hippo信號通路關(guān)鍵因子YAP1,研究CRIM1基因與Hippo信號通路之間的關(guān)系。檢測結(jié)果顯示我們成功地在A549中過表達了YAP1基因,并檢測到了細胞中CRIM1表達的顯著上調(diào)。得出結(jié)論:CRIM1的表達受到Hippo信號通路的調(diào)控。
【關(guān)鍵詞】：富半胱氨酸運動神經(jīng)元蛋白1 轉(zhuǎn)化生長因子β1 上皮間質(zhì)化 E-鈣粘素 N-鈣粘素
【學(xué)位授予單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2
【目錄】：

• 中文摘要3-4
• 英文摘要4-11
• 主要縮略詞11-13
• 1 緒論13-19
• 1.1 研究背景13-15
• 1.1.1 CRIM1 蛋白13
• 1.1.2 CRIM1 是癌相關(guān)蛋白的可能性探討13-15
• 1.1.3 肺癌的危害和分類15
• 1.2 本文創(chuàng)新點15
• 1.3 本文研究的目的，意義和內(nèi)容15-19
• 1.3.1 本研究的目的和意義15-16
• 1.3.2 本研究的主要內(nèi)容16
• 1.3.3 本研究的技術(shù)路線16-19
• 2 A549 細胞的培養(yǎng)和觀察19-23
• 2.1 引言19
• 2.2 實驗材料和設(shè)備19-20
• 2.2.1 細胞株19
• 2.2.2 細胞培養(yǎng)儀器19-20
• 2.2.3 細胞培養(yǎng)材料20
• 2.2.4 相關(guān)實驗材料準(zhǔn)備20
• 2.2.5 相關(guān)實驗試劑配制以及材料準(zhǔn)備20
• 2.3 實驗方法實驗結(jié)果20-22
• 2.3.1 細胞的復(fù)蘇與凍存21
• 2.3.2 細胞的換液和傳代21-22
• 2.4 細胞形態(tài)觀察22
• 2.5 本章小結(jié)22-23
• 3 siRNA轉(zhuǎn)染條件摸索以及沉默效率的確定23-39
• 3.1 引言23
• 3.2 實驗材料準(zhǔn)備與siRNA的合成23-25
• 3.2.1 實驗細胞23
• 3.2.2 實驗裝置和儀器23-24
• 3.2.3 實驗材料和試劑24-25
• 3.3 實驗方法25-32
• 3.3.1 細胞轉(zhuǎn)染條件摸索25
• 3.3.2 總RNA提取、檢測與反轉(zhuǎn)錄25-27
• 3.3.3 RT-PCR檢測基因表達27-28
• 3.3.4 總蛋白提取28
• 3.3.5 蛋白含量測定28-29
• 3.3.6 Western blot檢測蛋白表達29-32
• 3.4 實驗結(jié)果32-36
• 3.4.1 siRNA轉(zhuǎn)染條件的選擇32-33
• 3.4.2 SiRNA轉(zhuǎn)染后沉默效率的確定33-36
• 3.5 討論36-37
• 3.6 本章小結(jié)37-39
• 4 CRIM1 對A549 細胞增殖行為的影響39-45
• 4.1 引言39
• 4.2 實驗材料和設(shè)備39-40
• 4.2.1 實驗細胞39
• 4.2.2 實驗裝置與儀器39-40
• 4.2.3 實驗材料和試劑40
• 4.2.4 相關(guān)實驗試劑配制40
• 4.3 實驗方法40-41
• 4.3.1 siRNA的轉(zhuǎn)染40-41
• 4.3.2 CRIM1 多肽處理A549 細胞41
• 4.3.3 MTT法檢測增殖41
• 4.4 實驗結(jié)果41-43
• 4.4.1 CRIM1 的沉默對A549 細胞增殖的作用41-42
• 4.4.2 CRIM1 多肽對于A549 細胞增殖的影響42-43
• 4.5 討論43
• 4.6 本章小結(jié)43-45
• 5 CRIM1 對A549 細胞遷移的影響45-51
• 5.1 引言45
• 5.2 實驗材料和設(shè)備45-46
• 5.2.1 實驗細胞45
• 5.2.2 細胞培養(yǎng)的裝置和儀器45-46
• 5.2.3 實驗材料和試劑46
• 5.3 實驗方法46
• 5.3.1 siRNA的轉(zhuǎn)染后劃痕46
• 5.3.2 加入CRIM1 多肽并劃痕46
• 5.4 實驗結(jié)果46-49
• 5.4.1 CRIM1 的沉默抑制A549 細胞遷移46-47
• 5.4.2 加入CRIM1 多肽促進A549 細胞遷移47-49
• 5.5 討論49
• 5.6 本章小結(jié)49-51
• 6 CRIM1 對A549 細胞粘附的影響51-57
• 6.1 引言51
• 6.2 實驗材料和設(shè)備51-52
• 6.2.1 實驗細胞51
• 6.2.2 細胞培養(yǎng)的裝置和儀器51
• 6.2.3 實驗材料和試劑51-52
• 6.2.4 相關(guān)試劑的配制52
• 6.3 實驗方法52-53
• 6.3.1 siRNA的轉(zhuǎn)染52
• 6.3.2 CRIM1 多肽處理細胞52
• 6.3.3 粘附分析52-53
• 6.4 實驗結(jié)果53-54
• 6.4.1 CRIM1 的沉默抑制A549 細胞粘附53
• 6.4.2 加入CRIM1 多肽促進A549 細胞粘附53-54
• 6.5 討論54-55
• 6.6 本章小結(jié)55-57
• 7 CRIM1 與EMT之間的關(guān)系的研究57-69
• 7.1 引言57-58
• 7.2 實驗材料和方法58-59
• 7.2.1 實驗細胞58
• 7.2.2 實驗裝置和儀器58
• 7.2.3 實驗材料和試劑58-59
• 7.3 實驗方法59-63
• 7.3.1 TGFβ1 誘導(dǎo)EMT59
• 7.3.2 CRIM1 加樣誘導(dǎo)59-60
• 7.3.3 CRIM1 參與的TGFβ1 誘導(dǎo)60
• 7.3.4 siRNA的轉(zhuǎn)染60
• 7.3.5 總RNA的提取、檢測及反轉(zhuǎn)錄60
• 7.3.6 RT-PCR檢測基因的表達60-61
• 7.3.7 q-PCR檢測基因表達61-62
• 7.3.8 總蛋白的提取62
• 7.3.9 蛋白含量檢測62
• 7.3.10 Western blot檢測目的蛋白表達量62-63
• 7.4 實驗結(jié)果63-67
• 7.4.1 A549 發(fā)生EMT過程中CRIM1 表達檢測63-64
• 7.4.2 CRIM1 與EMT64-67
• 7.5 討論67-68
• 7.6 本章小結(jié)68-69
• 8 CRIM1 與Hippo信號通路的關(guān)系初探69-85
• 8.1 引言69-70
• 8.2 實驗材料和設(shè)備70-72
• 8.2.1 主要儀器和設(shè)備70-71
• 8.2.2 主要試劑71-72
• 8.3 實驗方法72-79
• 8.3.1 實驗準(zhǔn)備工作72
• 8.3.2 獲得目的片段72-74
• 8.3.3 質(zhì)粒構(gòu)建74-75
• 8.3.4 篩選陽性菌落75-76
• 8.3.5 質(zhì)粒提取76
• 8.3.6 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染76-77
• 8.3.7 目的基因表達檢測77-78
• 8.3.8 目的基因蛋白表達檢測78-79
• 8.4 實驗結(jié)果79-81
• 8.4.1 pcDNA3.1（+）-EGFP- YAP1 的構(gòu)建79
• 8.4.2 YAP1 的過表達以及相關(guān)基因和蛋白的檢測79-81
• 8.5 討論81-83
• 8.6 本章小結(jié)83-85
• 9 結(jié)論與展望85-87
• 9.1 主要結(jié)論85
• 9.2 展望85-87
• 致謝87-89
• 參考文獻89-95
• 附錄95
• A. 作者在攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文95
• B. 作者在攻讀學(xué)位期間獲得的專利95

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 陳汝福,鄒聲泉;血管生成在肝門部膽管癌發(fā)生發(fā)展中作用的研究[J];中華普通外科雜志;2000年06期

2 高進,李存璽;細胞粘附機制與癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移[J];中國腫瘤生物治療雜志;1995年04期

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本文編號：926236