發(fā)布時(shí)間：2017-09-26 15:12

  本文關(guān)鍵詞：沉默CHAF1b對(duì)人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721生物學(xué)行為的影響

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【摘要】：目的:1、檢測(cè)染色質(zhì)組裝因子1(Chromatin assembly factor 1,CAF-1)的亞基p60(CHAF1b)在原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)情況,并分析其表達(dá)與臨床病理因素(性別、年齡、腫瘤直徑、門靜脈侵犯、肝硬化、分化程度、TNM分期)的關(guān)系。2、通過檢測(cè)CHAF1b基因RNAi的重組慢病毒對(duì)人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721增殖、凋亡、細(xì)胞周期、細(xì)胞克隆能力的影響,初步闡明CHAF1b在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。方法:1、收集經(jīng)手術(shù)切除的110例肝癌組織及相應(yīng)的癌旁組織(至少距離癌組織1cm),以及20例正常肝組織,采用免疫組化法檢測(cè)3種組織中CHAF1b的表達(dá)情況,并比較分析其表達(dá)差異與臨床病理因素(性別、年齡、腫瘤直徑、分化程度、門靜脈侵犯、肝硬化、TNM分期)的關(guān)系。2、采用real-time PCR在mRNA水平檢測(cè)目的基因(CHAF1b)在各種人肝癌細(xì)胞株(SMMC-7721、HepG2、Hep3B、Huh-7)中的表達(dá)情況。3、構(gòu)建針對(duì)CHAF1b基因的RNAi慢病毒表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染入人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721,分成CHAF1b-RNAi慢病毒組(實(shí)驗(yàn)組)和慢病毒空載組(對(duì)照組)。4、采用real-time PCR在mRNA水平檢測(cè)構(gòu)建的RNAi慢病毒對(duì)人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721中CHAF1b表達(dá)的抑制效果;并檢測(cè)抑制CHAF1b的表達(dá)后對(duì)細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞克隆形成能力的影響。結(jié)果:1、以CHAF1b抗體行HCC、癌旁組織及正常肝組織免疫組織化學(xué)染色,細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為CHAF1b表達(dá)陽性。CHAF1b在HCC、癌旁組織及正常肝組織中的陽性率分別為63.6%(70/110)、3.6%(4/110)、0.0%(0/20),三者之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001),其中CHAF1b在肝癌組織中陽性率高于癌旁組織,CHAF1b在肝癌組織中的陽性率高于正常組織,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。CHAF1b在肝癌組織中的表達(dá)與性別、年齡、門靜脈侵犯、肝硬化、分化程度及TNM分期無關(guān)(P0.05),與腫瘤直徑有關(guān)(P0.05)。2、人肝癌細(xì)胞株SMMC-7221中有CHAF1b m RNA顯著表達(dá)。3、成功構(gòu)建了針對(duì)CHAF1b基因的RNAi慢病毒表達(dá)載體,并經(jīng)PCR和測(cè)序鑒定干擾片段的堿基序列及插入位點(diǎn)完全正確。4、構(gòu)建的RNAi慢病毒感染人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721后可使CHAF1b mRNA表達(dá)量顯著下降(P=0.006);Cellomics細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng):實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的生長(zhǎng)明顯慢于對(duì)照組(P0.05);FACS細(xì)胞周期檢測(cè):實(shí)驗(yàn)組G1的細(xì)胞顯著減少(P0.05),G2/M期與S期細(xì)胞顯著增多(P0.05);Annexin V-APC單染法流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡:實(shí)驗(yàn)組發(fā)生凋亡的細(xì)胞明顯高于對(duì)照組(P0.05);細(xì)胞克隆形成檢測(cè):實(shí)驗(yàn)組SMMC-7721細(xì)胞集落數(shù)目明顯低于對(duì)照組(P0.05);MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖:實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞MTT值比值(即增殖倍數(shù))低于對(duì)照組(P0.05)。結(jié)論:1.肝癌組織的CHAF1b的表達(dá)明顯高于癌旁組織及正常肝組織,肝癌組織的CHAF1b的表達(dá)情況與性別、年齡、門靜脈侵犯、肝硬化、分化程度及TNM分期無關(guān),與腫瘤直徑有關(guān)。2.人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721表達(dá)CHAF1b。3.構(gòu)建的針對(duì)CHAF1b基因的RNAi慢病毒表達(dá)載體能有效抑制CHAF1b基因的表達(dá),干擾CHAF1b基因表達(dá)后能顯著抑制的人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721的增殖能力,促進(jìn)其凋亡,影響其細(xì)胞周期。
【關(guān)鍵詞】：CHAF1b 肝細(xì)胞癌 SMMC-7721 RNA干擾
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.7
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-11
• 中英文縮略詞表11-12
• 第1章 引言12-14
• 第2章 CHAF1b在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及其臨床意義14-19
• 2.1 研究對(duì)象14
• 2.2 主要儀器和試劑14-15
• 2.2.1 主要儀器14-15
• 2.2.2 主要試劑15
• 2.3 實(shí)驗(yàn)步驟15
• 2.4 設(shè)立對(duì)照15-16
• 2.5 結(jié)果判定16
• 2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法16
• 2.7 結(jié)果16-18
• 2.7.1 肝癌組、癌旁組、正常組中CHAF1b的表達(dá)16-17
• 2.7.2 CHAF1b的表達(dá)與肝癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系17-18
• 2.8 結(jié)論18-19
• 第3章 CHAF1b在人肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)19-24
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料19
• 3.1.1 研究對(duì)象19
• 3.1.2 主要儀器與試劑19
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法19-23
• 3.2.1 引物設(shè)計(jì)19-20
• 3.2.2 實(shí)驗(yàn)步驟20-23
• 3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法23
• 3.4 結(jié)果23
• 3.5 結(jié)論23-24
• 第4章 CHAF1b基因RNA干擾慢病毒載體的構(gòu)建與包裝24-34
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料24-25
• 4.1.1 慢病毒載體系統(tǒng)24
• 4.1.2 細(xì)胞與菌株24
• 4.1.3 主要儀器24
• 4.1.4 主要試劑24-25
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法25-31
• 4.2.1 CHAF1b基因RNA干擾慢病毒載體的制備25-29
• 4.2.2 慢病毒包裝29-31
• 4.3 結(jié)果31-33
• 4.3.1 載體酶切線性化31
• 4.3.2 目的基因陽性克隆31-32
• 4.3.3 陽性克隆測(cè)序結(jié)果分析32-33
• 4.4 結(jié)論33-34
• 第5章 重組慢病毒對(duì)人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721的生物學(xué)影響34-44
• 5.1 研究對(duì)象34
• 5.2 主要儀器和試劑34-35
• 5.2.1 主要儀器34
• 5.2.2 主要試劑34-35
• 5.3 實(shí)驗(yàn)方法35-38
• 5.3.1 慢病毒感染目的細(xì)胞35-36
• 5.3.2 Real-time PCR檢測(cè)敲減效率36
• 5.3.3 Cellomics細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)36
• 5.3.4 FACS細(xì)胞周期檢測(cè)36-37
• 5.3.5 Annexin V-APC單染法流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡37
• 5.3.6 細(xì)胞克隆形成檢測(cè)37
• 5.3.7 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖37-38
• 5.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法38
• 5.5 結(jié)果38-42
• 5.5.1 慢病毒轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)38-39
• 5.5.2 Real-time PCR檢測(cè)敲減效率結(jié)果39-40
• 5.5.3 Cellomics細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)結(jié)果40
• 5.5.4 FACS細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果40-41
• 5.5.5 Annexin V-APC單染法流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果41
• 5.5.6 細(xì)胞克隆形成檢測(cè)結(jié)果41-42
• 5.5.7 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖結(jié)果42
• 5.6 結(jié)論42-44
• 第6章 討論44-47
• 6.1 目的基因的選擇44
• 6.2 免疫組織化學(xué)技術(shù)和Real-time PCR44-45
• 6.3 RNA干擾技術(shù)與慢病毒載體45
• 6.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)45
• 6.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)論45-47
• 致謝47-48
• 參考文獻(xiàn)48-52
• 綜述52-58
• 參考文獻(xiàn)56-58

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