本文關鍵詞：LOXL2對肝癌血管生成擬態(tài)及臨床預后的影響

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【摘要】：研究目的:肝細胞肝癌已位列第二大致死性腫瘤,其高發(fā)病率和高致死率的主要原因是血管侵犯和轉(zhuǎn)移。因此對于腫瘤轉(zhuǎn)移和血管生成的進一步研究,將會更好地提升腫瘤的抗血管治療效果,提升肝癌患者的生存質(zhì)量。本實驗檢測LOXL2(lysyl oxidase like 2)、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相關分子SNAIL、血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry,VM)形成的標記蛋白VE-cadherin及細胞極性蛋白LLGL2(Lethal giant larvae2)在肝癌中的表達情況并探討它們之間的關系;然后分析LOXL2的表達與年齡、性別、腫瘤大小及臨床分期等各種臨床資料的關系;探究LOXL2與VM兩者對于肝細胞肝癌(HCC)的生存時間及其臨床預后的影響,從而更好地闡述LOXL2對于肝細胞肝癌VM形成、轉(zhuǎn)移及預后的影響和意義。同時在體外實驗中細胞轉(zhuǎn)染、分子生物學技術等方法來進一步探究LOXL2對于體外腫瘤細胞的成管、侵襲和遷移能力影響,從而了解其對于腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移能力及VM形成的影響�？傊�,對于LOXL2在肝細胞肝癌VM形成及臨床預后的影響的初步研究,將會為肝細胞肝癌的診斷治療尋找到潛在的預后預測分子,并為肝細胞肝癌的治療提供一定的借鑒。研究方法:1.收集來自天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院和天津醫(yī)科大學總醫(yī)院的201例肝細胞肝癌病例,采用免疫組化方法檢測肝細胞肝癌樣本中LOXL2、LLGL2、SNAIL和VE-cadherin的表達情況并分析他們之間的相關性,然后采用CD31/PAS雙染的方法檢測肝細胞肝癌中VM的情況并分析VM與其他蛋白表達的相關性。同時,為了進一步了解肝細胞肝癌組織內(nèi)LOXL2及相關分子在m RNA水平的情況,我們針對64例肝癌冰凍組織進行了實時定量PCR(q RT-PCR)的實驗來檢測LOXL2與其相關基因的表達情況。第二,針對201例臨床病例資料進行回顧性分析,結合臨床資料通過X2和Spearson相關分析來研究LOXL2表達與年齡、性別、腫瘤大小、VM形成及臨床分期等臨床資料的關系;第三,采用判別分析對160例HCC病例建立判別公式,并在剩余60例肝癌病例中,對比分析來檢測LOXL2對于肝癌轉(zhuǎn)移的預測價值;最后,采用Kaplan-Meier來探究LOXL2和VM形成對于腫瘤患者生存時間及兩者共同對于腫瘤患者生存時間的影響;并采用Cox比例風險模型分析LOXL2對于肝細胞肝癌預后的價值。2.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染篩選構建出LOXL2高表達/降表達的肝細胞肝癌細胞系,進而通過體外三維培養(yǎng)來觀察LOXL2對于體外VM形成能力的影響,并通過劃痕、Transwell侵襲等細胞功能學實驗來初步觀察LOXL2對于腫瘤細胞遷移和侵襲能力的影響。研究結果:1.針對201例肝細胞肝癌病例的免疫組化結果顯示:LOXL2在肝癌細胞中的胞質(zhì)和胞核中均表達,SNAIL大部分在肝癌細胞的胞核中表達,LLGL2表達于肝癌細胞的胞質(zhì),而VE-cadherin在肝癌細胞中的胞核中表達。201例肝細胞肝癌中,LOXL2在胞漿中表達率為52.2%,在胞核的表達率為52.7%;SNAIL陽性率為76.1%;而VE-cadherin陽性率為21.9%;而LLGL2的陽性率為24.3%。相關性分析顯示:LOXL2漿表達、EMT調(diào)控者SNAIL的核表達及VM的標記物VE-cadherin的漿表達之間分別存在著一定的相關性(R=0.165 P=0.019;R=0.235P=0.001;R=0.152 P=0.031;R=0.071 P=0.031);而LOXL2的核表達,LLGL2的漿表達及VE-cadherin的表達卻與其他蛋白不相關(R=0.110 P=0.119;R=0.043P=0.541;R=0.069 P=0.324)。2.q RT-PCR的結果顯示:結果顯示:LOXL2、Snail、VE-cadherin等蛋白在肝細胞肝癌組的m RNA表達水平明顯高于其在正常組中的表達水平(P=0.033,P=0.034,P=0.024)。而細胞極性形成的相關蛋白LLGL2則正好相反(P=0.045)。相關性分析顯示:在m RNA水平上,LOXL2與SNAIL、VE-cad正相關,與LLGL2負相關,這與免疫組化中的相關性分析是一致的。3.免疫組化CD31-PAS雙染結果顯示:201例肝細胞肝癌病例中,48的肝癌病例發(fā)現(xiàn)了VM的存在。而153例沒有發(fā)現(xiàn)VM的存在。在VM形成組的48例中,34例的肝細胞肝癌病例中LOXL2漿表達,表達率高達70.8%,而相應的無VM形成組153例肝癌病例中,僅有約占46%(71例)的病例呈現(xiàn)LOXL2漿表達。兩組之間存在顯著性差異(p=0.005);相關性分析也顯示LOXL2的表達與VM形成呈正相關的關系(r=0.209,p=0.003)4.LOXL2的臨床病理資料分析顯示:LOXL2蛋白的漿表達在轉(zhuǎn)移組中的陽性率明顯大于其在非轉(zhuǎn)移組的陽性率。另一個因子SNAIL作為EMT的相關因子在轉(zhuǎn)移組也呈現(xiàn)高表達的水平,且表達水平與非轉(zhuǎn)移組相比具有顯著性差異(P=0.002)。同時LOXL2在病理分級III+IV組中的蛋白表達水平明顯高于I+II組(P=0.002)。即,LOXL2在201例肝細胞肝癌組織中的漿表達與腫瘤分級和轉(zhuǎn)移等臨床病理特征密切相關,而跟病人的年齡、性別及腫瘤大小未見明顯相關。而跟病人的年齡、性別及腫瘤大小未見明顯相關(P=0.302;P=0.337;P=0.388)。同時判別分析顯示LOXL2對于肝癌轉(zhuǎn)移的預測具有很好的價值。5.Kaplan-Meier生存分析顯示:LOXL2漿表達的患者其總體生存時間(OS)和無病生存時間(DFS)明顯地較LOXL2漿表達陰性的患者短(P0.005)。VM陽性表達的病例相比于VM陰性表達的病例其總體生存時間(OS)和無病生存時間(DFS)更短(P0.005)同時具有VM和LOXL2漿表達的病例組,其DFS和OS平均值相比于不是VM形成和LOXL2漿表達的雙陽的病例組明顯較短(P=0.000)。Cox分析顯示:LOXL2漿表達和VM形成是病人整體生存時間(P0.001;HR=2.155;CI:1.123 4.136;P0.05;HR=3.378;CI:1.942 5.878,P0.05)和無病生存時間(P0.001;HR=1.782;CI:1.037 3.063;P0.05;HR=3.705;CI:2.282 6.016,P0.01)的獨立預后因子。6.在體外三維培養(yǎng)實驗結果顯示:高表達LOXL2蛋白的Hep G2-LOXL2上調(diào)細胞系中,細胞在三維實驗中的管道樣結構形成能力明顯較對照組Hep G2-control細胞系明顯提升。另一方面在穩(wěn)定降表達LOXL2蛋白的Bel7402-sh LOXL2細胞系,其在三維實驗中的管道樣結構形成能力較對照組呈明顯性降低。7.在體外劃痕遷移和Transwell侵襲實驗中,高表達LOXL2蛋白的Hep G2相比對照組細胞系其遷移和侵襲能力明顯提升(P0.05);而經(jīng)轉(zhuǎn)染漿表達LOXL2蛋白的Bel7402-sh LOXL2相比對于對照組的Bel7402-control細胞系其遷移和侵襲能力明顯降低(P0.05)。8.針對肝細胞肝癌細胞系的實時定量PCR的結果顯示:LOXL2m RNA的高表達促進VM形成的標記蛋白VE-cadherin的m RNA水平的表達,并降低細胞極性蛋白LLGL2的m RNA水平的表達(P0.05),但是對于SNAIL的促進效果卻不明顯;另一方面,LOXL2m RNA的低表達將會抑制VM形成的標記蛋白VE-cadherin的m RNA水平的表達,同時促進細胞極性蛋白LLGL2的m RNA水平的表達(P0.05),但是對于SNAIL的抑制效果并不明顯;。研究結論:1.LOXL2漿表達與臨床分級和轉(zhuǎn)移明顯相關,而與年齡及性別等臨床資料不相關。2.LOXL2促進肝細胞肝癌中VM的形成,并與肝癌的不良預后密切相關。3.LOXL2漿表達和VM形成是病人整體生存時間和無病生存時間的獨立預后因子。4.LOXL2以促進腫瘤細胞的侵襲、遷移能力及管道樣結構形成能力。5.LOXL2可能通過促進SNAIL,抑制LLGL2從而促進EMT和VM形成。
【關鍵詞】：LOXL2 血管生成擬態(tài) 肝細胞肝癌 預后因子
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• Abstract8-13
• 縮略語13-14
• 前言14-20
• 研究現(xiàn)狀、成果14-18
• 研究目的、方法18-20
• 一、LOXL2在肝細胞肝癌中的表達及其與EMT及VM的關系20-40
• 1.1 對象和方法20-23
• 1.1.1 臨床病例20
• 1.1.2 實驗儀器和試劑20-21
• 1.1.3 免疫組化21-22
• 1.1.4 CD31與PAS雙重染色22
• 1.1.5 實驗結果判斷22-23
• 1.1.6 統(tǒng)計學方法23
• 1.2 結果23-35
• 1.2.1 LOXL2與EMT相關基因在肝細胞肝癌中的表達及三者間的關系 ..· 101.2.2 肝細胞肝癌中LOXL2及其相關蛋白的m RNA表達水平23-26
• 1.2.2 肝細胞肝癌中 LOXL2 及其相關蛋白的 m RNA 表達水平26-28
• 1.2.3 LOXL2與臨床病理特征的關系28-30
• 1.2.4 LOXL2與血管生成擬態(tài)的關系30-32
• 1.2.5 LOXL2對于肝細胞肝癌的預后價值32-35
• 1.3 討論35-39
• 1.3.1 LOXL2蛋白在肝細胞肝癌中高表達并與EMT相關蛋白SNAIL及VM形成的標記蛋白VE-cadherin的表達密切相關36-38
• 1.3.2 LOXL2的漿表達與臨床分級、轉(zhuǎn)移和不良預后結果明顯相關38-39
• 1.4 小結39-40
• 二、LOXL2對肝細胞肝癌中體外形成VM的影響40-67
• 2.1 對象和方法40-54
• 2.1.1 實驗儀器和試劑40-44
• 2.1.2 細胞實驗44-45
• 2.1.3 質(zhì)粒提取及轉(zhuǎn)染45-49
• 2.1.4 Western blot蛋白印記實驗49-50
• 2.1.5 細胞功能學實驗50-52
• 2.1.6 RNA的提取及實時定量PCR52-54
• 2.1.7 統(tǒng)計學方法54
• 2.2 結果54-62
• 2.2.1 肝細胞肝癌細胞系中LOXL2蛋白的表達及通過穩(wěn)轉(zhuǎn)建立LOXL2過/降表達細胞系54-56
• 2.2.2 在體外實驗中LOXL2對于肝癌細胞管道樣結構形成能力的影響56-57
• 2.2.3 在體外實驗中LOXL2對于肝癌細胞侵襲、遷移能力的影響57-59
• 2.2.4 LOXL2通過調(diào)控EMT相關因子的m RNA水平來調(diào)控LOXL2蛋白的表達59
• 2.2.5 LOXL2 通過調(diào)控 EMT 相關因子的 m RNA 水平來調(diào)控 LOXL2 蛋白的表達59-62
• 2.3 討論62-66
• 2.4 小結66-67
• 結論67-68
• 參考文獻68-76
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明76-77
• 綜述 細胞極性與血管生成的研究進展77-86
• 綜述參考文獻82-86
• 致謝86-87
• 個人簡歷87

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本文編號：914066