發(fā)布時(shí)間：2017-09-24 23:26

  本文關(guān)鍵詞：LOXL2對(duì)肝癌血管生成擬態(tài)及臨床預(yù)后的影響

  更多相關(guān)文章： LOXL2 血管生成擬態(tài) 肝細(xì)胞肝癌 預(yù)后因子

【摘要】：研究目的:肝細(xì)胞肝癌已位列第二大致死性腫瘤,其高發(fā)病率和高致死率的主要原因是血管侵犯和轉(zhuǎn)移。因此對(duì)于腫瘤轉(zhuǎn)移和血管生成的進(jìn)一步研究,將會(huì)更好地提升腫瘤的抗血管治療效果,提升肝癌患者的生存質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LOXL2(lysyl oxidase like 2)、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相關(guān)分子SNAIL、血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry,VM)形成的標(biāo)記蛋白VE-cadherin及細(xì)胞極性蛋白LLGL2(Lethal giant larvae2)在肝癌中的表達(dá)情況并探討它們之間的關(guān)系;然后分析LOXL2的表達(dá)與年齡、性別、腫瘤大小及臨床分期等各種臨床資料的關(guān)系;探究LOXL2與VM兩者對(duì)于肝細(xì)胞肝癌(HCC)的生存時(shí)間及其臨床預(yù)后的影響,從而更好地闡述LOXL2對(duì)于肝細(xì)胞肝癌VM形成、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的影響和意義。同時(shí)在體外實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞轉(zhuǎn)染、分子生物學(xué)技術(shù)等方法來(lái)進(jìn)一步探究LOXL2對(duì)于體外腫瘤細(xì)胞的成管、侵襲和遷移能力影響,從而了解其對(duì)于腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力及VM形成的影響�？傊�,對(duì)于LOXL2在肝細(xì)胞肝癌VM形成及臨床預(yù)后的影響的初步研究,將會(huì)為肝細(xì)胞肝癌的診斷治療尋找到潛在的預(yù)后預(yù)測(cè)分子,并為肝細(xì)胞肝癌的治療提供一定的借鑒。研究方法:1.收集來(lái)自天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院和天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院的201例肝細(xì)胞肝癌病例,采用免疫組化方法檢測(cè)肝細(xì)胞肝癌樣本中LOXL2、LLGL2、SNAIL和VE-cadherin的表達(dá)情況并分析他們之間的相關(guān)性,然后采用CD31/PAS雙染的方法檢測(cè)肝細(xì)胞肝癌中VM的情況并分析VM與其他蛋白表達(dá)的相關(guān)性。同時(shí),為了進(jìn)一步了解肝細(xì)胞肝癌組織內(nèi)LOXL2及相關(guān)分子在m RNA水平的情況,我們針對(duì)64例肝癌冰凍組織進(jìn)行了實(shí)時(shí)定量PCR(q RT-PCR)的實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)LOXL2與其相關(guān)基因的表達(dá)情況。第二,針對(duì)201例臨床病例資料進(jìn)行回顧性分析,結(jié)合臨床資料通過X2和Spearson相關(guān)分析來(lái)研究LOXL2表達(dá)與年齡、性別、腫瘤大小、VM形成及臨床分期等臨床資料的關(guān)系;第三,采用判別分析對(duì)160例HCC病例建立判別公式,并在剩余60例肝癌病例中,對(duì)比分析來(lái)檢測(cè)LOXL2對(duì)于肝癌轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)價(jià)值;最后,采用Kaplan-Meier來(lái)探究LOXL2和VM形成對(duì)于腫瘤患者生存時(shí)間及兩者共同對(duì)于腫瘤患者生存時(shí)間的影響;并采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析LOXL2對(duì)于肝細(xì)胞肝癌預(yù)后的價(jià)值。2.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染篩選構(gòu)建出LOXL2高表達(dá)/降表達(dá)的肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞系,進(jìn)而通過體外三維培養(yǎng)來(lái)觀察LOXL2對(duì)于體外VM形成能力的影響,并通過劃痕、Transwell侵襲等細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)來(lái)初步觀察LOXL2對(duì)于腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。研究結(jié)果:1.針對(duì)201例肝細(xì)胞肝癌病例的免疫組化結(jié)果顯示:LOXL2在肝癌細(xì)胞中的胞質(zhì)和胞核中均表達(dá),SNAIL大部分在肝癌細(xì)胞的胞核中表達(dá),LLGL2表達(dá)于肝癌細(xì)胞的胞質(zhì),而VE-cadherin在肝癌細(xì)胞中的胞核中表達(dá)。201例肝細(xì)胞肝癌中,LOXL2在胞漿中表達(dá)率為52.2%,在胞核的表達(dá)率為52.7%;SNAIL陽(yáng)性率為76.1%;而VE-cadherin陽(yáng)性率為21.9%;而LLGL2的陽(yáng)性率為24.3%。相關(guān)性分析顯示:LOXL2漿表達(dá)、EMT調(diào)控者SNAIL的核表達(dá)及VM的標(biāo)記物VE-cadherin的漿表達(dá)之間分別存在著一定的相關(guān)性(R=0.165 P=0.019;R=0.235P=0.001;R=0.152 P=0.031;R=0.071 P=0.031);而LOXL2的核表達(dá),LLGL2的漿表達(dá)及VE-cadherin的表達(dá)卻與其他蛋白不相關(guān)(R=0.110 P=0.119;R=0.043P=0.541;R=0.069 P=0.324)。2.q RT-PCR的結(jié)果顯示:結(jié)果顯示:LOXL2、Snail、VE-cadherin等蛋白在肝細(xì)胞肝癌組的m RNA表達(dá)水平明顯高于其在正常組中的表達(dá)水平(P=0.033,P=0.034,P=0.024)。而細(xì)胞極性形成的相關(guān)蛋白LLGL2則正好相反(P=0.045)。相關(guān)性分析顯示:在m RNA水平上,LOXL2與SNAIL、VE-cad正相關(guān),與LLGL2負(fù)相關(guān),這與免疫組化中的相關(guān)性分析是一致的。3.免疫組化CD31-PAS雙染結(jié)果顯示:201例肝細(xì)胞肝癌病例中,48的肝癌病例發(fā)現(xiàn)了VM的存在。而153例沒有發(fā)現(xiàn)VM的存在。在VM形成組的48例中,34例的肝細(xì)胞肝癌病例中LOXL2漿表達(dá),表達(dá)率高達(dá)70.8%,而相應(yīng)的無(wú)VM形成組153例肝癌病例中,僅有約占46%(71例)的病例呈現(xiàn)LOXL2漿表達(dá)。兩組之間存在顯著性差異(p=0.005);相關(guān)性分析也顯示LOXL2的表達(dá)與VM形成呈正相關(guān)的關(guān)系(r=0.209,p=0.003)4.LOXL2的臨床病理資料分析顯示:LOXL2蛋白的漿表達(dá)在轉(zhuǎn)移組中的陽(yáng)性率明顯大于其在非轉(zhuǎn)移組的陽(yáng)性率。另一個(gè)因子SNAIL作為EMT的相關(guān)因子在轉(zhuǎn)移組也呈現(xiàn)高表達(dá)的水平,且表達(dá)水平與非轉(zhuǎn)移組相比具有顯著性差異(P=0.002)。同時(shí)LOXL2在病理分級(jí)III+IV組中的蛋白表達(dá)水平明顯高于I+II組(P=0.002)。即,LOXL2在201例肝細(xì)胞肝癌組織中的漿表達(dá)與腫瘤分級(jí)和轉(zhuǎn)移等臨床病理特征密切相關(guān),而跟病人的年齡、性別及腫瘤大小未見明顯相關(guān)。而跟病人的年齡、性別及腫瘤大小未見明顯相關(guān)(P=0.302;P=0.337;P=0.388)。同時(shí)判別分析顯示LOXL2對(duì)于肝癌轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)具有很好的價(jià)值。5.Kaplan-Meier生存分析顯示:LOXL2漿表達(dá)的患者其總體生存時(shí)間(OS)和無(wú)病生存時(shí)間(DFS)明顯地較LOXL2漿表達(dá)陰性的患者短(P0.005)。VM陽(yáng)性表達(dá)的病例相比于VM陰性表達(dá)的病例其總體生存時(shí)間(OS)和無(wú)病生存時(shí)間(DFS)更短(P0.005)同時(shí)具有VM和LOXL2漿表達(dá)的病例組,其DFS和OS平均值相比于不是VM形成和LOXL2漿表達(dá)的雙陽(yáng)的病例組明顯較短(P=0.000)。Cox分析顯示:LOXL2漿表達(dá)和VM形成是病人整體生存時(shí)間(P0.001;HR=2.155;CI:1.123 4.136;P0.05;HR=3.378;CI:1.942 5.878,P0.05)和無(wú)病生存時(shí)間(P0.001;HR=1.782;CI:1.037 3.063;P0.05;HR=3.705;CI:2.282 6.016,P0.01)的獨(dú)立預(yù)后因子。6.在體外三維培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:高表達(dá)LOXL2蛋白的Hep G2-LOXL2上調(diào)細(xì)胞系中,細(xì)胞在三維實(shí)驗(yàn)中的管道樣結(jié)構(gòu)形成能力明顯較對(duì)照組Hep G2-control細(xì)胞系明顯提升。另一方面在穩(wěn)定降表達(dá)LOXL2蛋白的Bel7402-sh LOXL2細(xì)胞系,其在三維實(shí)驗(yàn)中的管道樣結(jié)構(gòu)形成能力較對(duì)照組呈明顯性降低。7.在體外劃痕遷移和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)中,高表達(dá)LOXL2蛋白的Hep G2相比對(duì)照組細(xì)胞系其遷移和侵襲能力明顯提升(P0.05);而經(jīng)轉(zhuǎn)染漿表達(dá)LOXL2蛋白的Bel7402-sh LOXL2相比對(duì)于對(duì)照組的Bel7402-control細(xì)胞系其遷移和侵襲能力明顯降低(P0.05)。8.針對(duì)肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞系的實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果顯示:LOXL2m RNA的高表達(dá)促進(jìn)VM形成的標(biāo)記蛋白VE-cadherin的m RNA水平的表達(dá),并降低細(xì)胞極性蛋白LLGL2的m RNA水平的表達(dá)(P0.05),但是對(duì)于SNAIL的促進(jìn)效果卻不明顯;另一方面,LOXL2m RNA的低表達(dá)將會(huì)抑制VM形成的標(biāo)記蛋白VE-cadherin的m RNA水平的表達(dá),同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞極性蛋白LLGL2的m RNA水平的表達(dá)(P0.05),但是對(duì)于SNAIL的抑制效果并不明顯;。研究結(jié)論:1.LOXL2漿表達(dá)與臨床分級(jí)和轉(zhuǎn)移明顯相關(guān),而與年齡及性別等臨床資料不相關(guān)。2.LOXL2促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌中VM的形成,并與肝癌的不良預(yù)后密切相關(guān)。3.LOXL2漿表達(dá)和VM形成是病人整體生存時(shí)間和無(wú)病生存時(shí)間的獨(dú)立預(yù)后因子。4.LOXL2以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移能力及管道樣結(jié)構(gòu)形成能力。5.LOXL2可能通過促進(jìn)SNAIL,抑制LLGL2從而促進(jìn)EMT和VM形成。
【關(guān)鍵詞】：LOXL2 血管生成擬態(tài) 肝細(xì)胞肝癌 預(yù)后因子
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.7
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• Abstract8-13
• 縮略語(yǔ)13-14
• 前言14-20
• 研究現(xiàn)狀、成果14-18
• 研究目的、方法18-20
• 一、LOXL2在肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)及其與EMT及VM的關(guān)系20-40
• 1.1 對(duì)象和方法20-23
• 1.1.1 臨床病例20
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑20-21
• 1.1.3 免疫組化21-22
• 1.1.4 CD31與PAS雙重染色22
• 1.1.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷22-23
• 1.1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法23
• 1.2 結(jié)果23-35
• 1.2.1 LOXL2與EMT相關(guān)基因在肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)及三者間的關(guān)系 ..· 101.2.2 肝細(xì)胞肝癌中LOXL2及其相關(guān)蛋白的m RNA表達(dá)水平23-26
• 1.2.2 肝細(xì)胞肝癌中 LOXL2 及其相關(guān)蛋白的 m RNA 表達(dá)水平26-28
• 1.2.3 LOXL2與臨床病理特征的關(guān)系28-30
• 1.2.4 LOXL2與血管生成擬態(tài)的關(guān)系30-32
• 1.2.5 LOXL2對(duì)于肝細(xì)胞肝癌的預(yù)后價(jià)值32-35
• 1.3 討論35-39
• 1.3.1 LOXL2蛋白在肝細(xì)胞肝癌中高表達(dá)并與EMT相關(guān)蛋白SNAIL及VM形成的標(biāo)記蛋白VE-cadherin的表達(dá)密切相關(guān)36-38
• 1.3.2 LOXL2的漿表達(dá)與臨床分級(jí)、轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后結(jié)果明顯相關(guān)38-39
• 1.4 小結(jié)39-40
• 二、LOXL2對(duì)肝細(xì)胞肝癌中體外形成VM的影響40-67
• 2.1 對(duì)象和方法40-54
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑40-44
• 2.1.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)44-45
• 2.1.3 質(zhì)粒提取及轉(zhuǎn)染45-49
• 2.1.4 Western blot蛋白印記實(shí)驗(yàn)49-50
• 2.1.5 細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)50-52
• 2.1.6 RNA的提取及實(shí)時(shí)定量PCR52-54
• 2.1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法54
• 2.2 結(jié)果54-62
• 2.2.1 肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞系中LOXL2蛋白的表達(dá)及通過穩(wěn)轉(zhuǎn)建立LOXL2過/降表達(dá)細(xì)胞系54-56
• 2.2.2 在體外實(shí)驗(yàn)中LOXL2對(duì)于肝癌細(xì)胞管道樣結(jié)構(gòu)形成能力的影響56-57
• 2.2.3 在體外實(shí)驗(yàn)中LOXL2對(duì)于肝癌細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響57-59
• 2.2.4 LOXL2通過調(diào)控EMT相關(guān)因子的m RNA水平來(lái)調(diào)控LOXL2蛋白的表達(dá)59
• 2.2.5 LOXL2 通過調(diào)控 EMT 相關(guān)因子的 m RNA 水平來(lái)調(diào)控 LOXL2 蛋白的表達(dá)59-62
• 2.3 討論62-66
• 2.4 小結(jié)66-67
• 結(jié)論67-68
• 參考文獻(xiàn)68-76
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明76-77
• 綜述 細(xì)胞極性與血管生成的研究進(jìn)展77-86
• 綜述參考文獻(xiàn)82-86
• 致謝86-87
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷87

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本文編號(hào)：914066