本文關鍵詞：肝細胞癌HepG2中p53調控microRNA的表達譜構建和調控網絡分析

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【摘要】：p53作為腫瘤抑制關鍵轉錄因子(Transcription Factor, TF),在DNA損傷等細胞壓力下被激活并介導參與多種腫瘤相關生物學過程,如細胞周期調控、細胞增殖、細胞凋亡、細胞侵襲和遷移等。作為腫瘤抑制因子,野生型p53蛋白通過轉錄激活或抑制下游與腫瘤相關基因表達,抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。MicroRNA(miRNA)是一類由21-24個核苷酸組成的內源性小非編碼RNA,最近研究已證實miRNA可受p53蛋白直接調控并參與到多個p53調控網絡之中。然而,目前在肝細胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)中p53調控miRNA表達譜以及p53-miRNA參與的調控網絡尚不清楚。本文利用抗癌藥物阿霉素(Doxorubicin, Dox)誘導HepG2細胞DNA損傷,激活p53信號通路。通過小RNA測序(Small RNA sequencing, small RNA-seq)檢測阿霉素處理肝癌細胞HepG2前后miRNA的差異表達情況,利用Targetscan、miRanda和’Tarbase軟件對miRNA靶基因進行預測,并使用GO與KEGG通路富集方法對差異表達miRNA靶基因進行功能富集分析。隨后通過整合分析p53 ChIP-seq與miRNA轉錄起始位點(Transcription start site, TSS)數據,識別miRNA轉錄起始位點上游10kb和下游1 kb假定啟動子區(qū)域是否存在p53蛋白結合位點,篩選出潛在受p53直接調控的miRNAs。最后選擇感興趣并在肝細胞癌中未曾報道的差異表達miRNA進行測序驗證,通過qRT-PCR方法檢測p53-miRNA表達變化,并利用CCK-8 (Cell Counting Kit-8)檢測miRNA對肝癌細胞增殖的影響。結果顯示在阿霉素誘導的DNA損傷條件下,HepG2細胞中p53蛋白表達顯著上調。經過兩次生物學重復小RNA測序,共篩選出33條顯著差異表達miRNAs,其中12條miRNAs上調,21條miRNAs表達下調。MiR2Disease疾病功能分析發(fā)現其中有8條miRNAs與肝癌細胞的發(fā)生發(fā)展過程相關。GO和KEGG通路富集分析結果顯示87.6%和90.9% miRNAs的靶基因分別參與到p53介導的細胞進程與信號通路中。MiRNA啟動子區(qū)p53結合位點分析顯示,33條顯著差異表達miRNAs中有18條miRNAs具備p53蛋白潛在結合位點,其中有7條miRNAs的啟動子區(qū)域含有多個p53蛋白結合位點,這意味著這些miRNA可能受p53的直接調控。通過qRT-PCR驗證肝細胞癌中未曾報道的差異表達miR-3661和miR-4521,結果顯示miR-3661表達量上調10.17倍,miR-4521表達量下調6.25倍,與測序結果趨勢一致。隨后探討了p53誘導顯著上調的miR-3661對HepG2增殖的影響,發(fā)現HepG2細胞中過表達miR-3661抑制HepG2細胞的增殖,抑制率為25.7%(P0.01)。最后構建和分析肝癌細胞HepG2在癌癥通路(Pathways in cancer)的p53-miRNA調控網絡,并對網絡中64條p53-miRNA-mRNA前反饋回路進行了分析。
【關鍵詞】：p53 microRNA 小RNA測序 肝細胞癌 調控網絡
【學位授予單位】：西南交通大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 摘要6-8
• abstract8-12
• 第1章 緒論12-23
• 1.1 p53與腫瘤12-15
• 1.1.1 p53結構與功能12-14
• 1.1.2 p53與DNA損傷14
• 1.1.3 p53介導的腫瘤相關生物進程和信號通路14-15
• 1.2 MicroRNA與腫瘤15-18
• 1.2.1 miRNA生物學合成與作用機制15-17
• 1.2.2 miRNA生物學功能17
• 1.2.3 miRNA與腫瘤17-18
• 1.3 p53與microRNA調控網絡18-20
• 1.3.1 p53-microRNA調控18-19
• 1.3.2 p53-microRNA網絡研究進展19-20
• 1.4 課題研究目的、意義和內容20-23
• 1.4.1 本課題的研究目的和意義20
• 1.4.2 本課題的研究內容20-22
• 1.4.3 本課題創(chuàng)新點22-23
• 第2章 肝癌細胞中DNA損傷誘導下p53調控microRNA的高通量篩選23-48
• 2.1 材料與方法23-32
• 2.1.1 細胞培養(yǎng)與阿霉素藥物處理23-25
• 2.1.2 mRNA水平檢測DNA損傷應激條件下p53與p21表達變化25-28
• 2.1.3 蛋白水平檢測DNA損傷應激條件下p53表達情況28-30
• 2.1.4 小RNA測序樣品的制備30-31
• 2.1.5 sRNA文庫構建與測序數據分析31-32
• 2.1.6 差異表達miRNA篩選32
• 2.1.7 miRNA的疾病功能分析32
• 2.2 結果與分析32-46
• 2.2.1 DNA損傷應激條件下p53與下游靶基因表達活化32-37
• 2.2.2 小RNA測序樣本總RNA純度及完整性鑒定37-38
• 2.2.3 小RNA長度分布、堿基偏好性和染色體分布特征38-41
• 2.2.4 HepG2細胞中受p53調控的差異表達miRNA篩選41-44
• 2.2.5 mir2disease介導的疾病功能分析44-46
• 2.3 討論46-47
• 2.4 本章小結47-48
• 第3章 p53調控差異表達miRNA靶基因預測與功能分析48-66
• 3.1 材料與方法48-52
• 3.1.1 miRNA靶基因預測48
• 3.1.2 Gene Ontology和KEGG通路富集分析48-49
• 3.1.3 p53結合位點ChIP-seq數據分析49
• 3.1.4 p53-miRNA-mRNA調控網絡構建49
• 3.1.5 差異表達miRNA的qRT-PCR驗證49-51
• 3.1.6 miR-3661對肝癌細胞HepG2增殖的影響51-52
• 3.2 結果與分析52-64
• 3.2.1 miRNA靶基因預測結果52
• 3.2.2 GO功能注釋結果52-54
• 3.2.3 KEGG信號通路富集分析結果54-56
• 3.2.4 p53-miRNA結合位點識別56-58
• 3.2.5 p53-miRNA-mRNA調控網絡構建58-60
• 3.2.6 差異表達miRNA qRT-PCR驗證結果60-62
• 3.2.7 miR-3661抑制HepG2細胞增殖62-64
• 3.3 討論64-65
• 3.4 本章小結65-66
• 結論66-67
• 致謝67-68
• 參考文獻68-77
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表的學術論文77

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1 陳勇;劉巍;;microRNA影響抗腫瘤藥物敏感性相關研究進展[J];臨床腫瘤學雜志;2009年09期

2 牛曉曉;王秦秦;;microRNA與肺癌[J];中國肺癌雜志;2010年04期

3 劉靜;王小中;;慢性粒細胞白血病相關microRNA的研究進展[J];分子診斷與治療雜志;2010年04期

4 LEE Younghee;LUSSIER Yves A;;Identification of common microRNA-mRNA regulatory biomodules in human epithelial cancer[J];Chinese Science Bulletin;2010年31期

5 唐志強;;The effect of microRNA-21-siRNA-lentivirus on biological behaviors in human hepatic cancer cell line hepG2[J];China Medical Abstracts(Surgery);2012年01期

6 ;PTEN and PDCD4 are Bona Fide Targets of microRNA-21 in Human Cholangiocarcinoma[J];Chinese Medical Sciences Journal;2012年02期

7 林建宇;朱雨捷;王晶;湯溢飛;徐中華;;急性冠狀動脈綜合征相關microRNA靶向通路及其功能分析[J];蘇州大學學報(醫(yī)學版);2012年04期

8 崔洪亮;張陽德;;microRNA的協同調控網的構建與研究[J];中國現代醫(yī)學雜志;2012年33期

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10 孟勝喜;胡義揚;馮琴;;microRNA在中醫(yī)藥防治非酒精性脂肪性肝病中的應用[J];中華中醫(yī)藥雜志;2014年03期

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1 荊清;袁文俊;秦永文;;microRNA的基因調控新功能[A];中國生理學會第五屆全國心血管、呼吸和腎臟生理學學術會議論文摘要匯編[C];2005年

2 靳新;駱志剛;王金華;管乃洋;;microRNA靶標研究進展[A];中國遺傳學會功能基因組學研討會論文集[C];2006年

3 ;Comparasion of Inhibitory Effects on Survivin Gene Expression in Prostate Cancer by Vector-based microRNA and siRNA[A];2008年全國生物化學與分子生物學學術大會論文摘要[C];2008年

4 朱丹霞;徐衛(wèi);繆扣榮;方成;朱華淵;董華潔;王冬梅;范磊;喬純;李建勇;;慢性淋巴細胞白血病microRNA異常表達研究[A];第13屆全國實驗血液學會議論文摘要[C];2011年

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1 陳英云 喬蕤琳;哈醫(yī)大成功研發(fā)國內首例microRNA轉基因及敲減小鼠模型[N];黑龍江經濟報;2010年

2 記者 陳青;2厘米以下肝癌檢出率88%[N];文匯報;2011年

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1 崔洪亮;microRNA的腫瘤表達研究及協同調控網絡分析[D];中南大學;2014年

2 馬建華;高粱低磷低氮形態(tài)生理特征及低氮響應的microRNA研究[D];山西農業(yè)大學;2014年

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9 李敏;活血化痰安神方對冠心病心絞痛痰瘀互結證患者臨床及microRNA研究[D];北京中醫(yī)藥大學;2016年

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