本文關鍵詞：腫瘤微環(huán)境中hUC-MSCs的生物學特性分析

  更多相關文章： hUC-MSCS 腫瘤微環(huán)境 生物學特性 BMSCS

【摘要】：目的通過構建人臍帶間充質(zhì)干細胞(human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells,hUC-MSCs)與MCF-7B乳腺癌細胞及U251腦膠質(zhì)瘤細胞非接觸共培養(yǎng)模型,探討hUC-MSCs在腫瘤微環(huán)境中生物學特性改變及其分子機制,為hUC-MSCs作為腫瘤靶向治療載體的臨床安全應用提供前期實驗基礎；通過構建SD大鼠腦膠質(zhì)瘤模型,腫瘤原位注射BMSCsCM-Dil (Bone Mesenchymal Stem Cells, BMSCs)并動態(tài)觀察其在腫瘤組織的分布,為BMSCs在體內(nèi)腦膠質(zhì)瘤微環(huán)境中惡性轉(zhuǎn)化的研究提供實驗模型。材料與方法1.實驗動物SPF級雄性裸鼠,6周齡,體重20±5g；SPF級雄性SD大鼠,3-5周齡,體重50±10 g；SPF級雄性SD大鼠,體重200-250 g；以上實驗動物購于“重慶醫(yī)科大學實驗動物中心”。2.細胞來源hUC-MSCs由重慶市干細胞治療工程技術研究中心惠贈；乳腺癌細胞系MCF-7B購自廣州吉妮歐生物科技有限公司；腦膠質(zhì)瘤細胞系U251購自中國科學院上海細胞庫；腦膠質(zhì)瘤細胞系C6來源于重慶醫(yī)科大學“兒科研究所”；大鼠BMSCs由骨髓貼壁法分離獲得。3.實驗分組研究共分為三部分：4.實驗方法第一部分及第二部分：hUC-MSCs在腫瘤微環(huán)境中生物學特性的檢測4.1非接觸共培養(yǎng)后,細胞形態(tài)學特征觀察。4.2流式細胞術檢測細胞周期時相分布。4.3 CCK-8檢測細胞增殖能力。4.4細胞染色體核型分析。4.5體內(nèi)裸鼠成瘤試驗及組織HE染色。4.6β-半乳糖苷酶染色檢測細胞衰老。4.7 RT-qPCR檢測各組hTERT.c-Myc和Bcl-x1的mRNA相對表達.4.8 Western b lot檢測各組p53.c-Myc和Bcl-x1蛋白表達。4.9細胞免疫熒光檢測c-Myc和Bcl-xl蛋白表達及定位。第三部分：腦膠質(zhì)瘤模型建立及BMSCsCM-Dil原位注射及其分布觀察4.10倒置顯微鏡下觀察CM-Dil熒光標記的BMSCs。4.11腦活體定位建立腦膠質(zhì)瘤模型。4.12 HE染色觀察腦膠質(zhì)瘤組織結構。4.13熒光顯微鏡下觀察BMSCs在腫瘤組織中的分布。結果第一部分及第二部分：hUC-MSCs在腫瘤微環(huán)境中的生物學特性分析1.各組細胞培養(yǎng)至P10代,兩實驗組hUC-MSCs呈多形性,大小不均核質(zhì)比略增大,細胞聚集成團狀生長,排列較紊亂呈輕度異型性。2.實驗組1和實驗組2的hUC-MSCs G1期比例顯著低于對照組(p0.05),S期和G2期細胞比例均顯著高于對照組(p0.05)。3.兩實驗組細胞增殖率在第2天到第6天均顯著高于空白對照組的hUC-MSCs (p0.05)。4.兩實驗組經(jīng)染色體分析,其染色體總數(shù)均為46條,分為23對(46,XX),G顯帶未見染色體結構出現(xiàn)明顯異常的改變。5.8W后空白對照組及兩實驗組裸鼠死亡未見包塊形成。HE染色顯示,空白對照組及兩實驗組皮下肌肉組織結構正常,排列規(guī)則,細胞胞質(zhì)染為紅色,多個扁平胞核分布于細胞邊緣,呈藍色。6.培養(yǎng)至6Wβ-半乳糖苷酶染色顯示,實驗組1與實驗組2 SA-P-gal活性細胞比例顯著高于空白對照組(p0.05)。7.實驗組1和實驗組2細胞c-Myc和Bcl-xl的mRNA相對表達量與空白對照組相比均顯著增高,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05),而實驗組hTERT mRNA水平與空白對照組比較無顯著差異,且較陽性對照組,其表達量極低。8.實驗組1和實驗組2細胞p53、c-Myc和Bcl-xl蛋白相對表達量均顯著高于空白對照組,差別有統(tǒng)計學意義(p0.05)。9.c-Myc蛋白定位于細胞核,兩實驗組陽性率均顯著高于空白對照組(p0.05)；Bcl-xl胞質(zhì)與胞核均有表達,主要定位于細胞核外膜,兩實驗組陽性表達率均顯著高于空白對照組(p0.05)。第三部分：腦膠質(zhì)瘤模型建立及BMSCsCM-Dil原位注射及分布觀察10.CM-Dil標記的BMSCs呈現(xiàn)紅色熒光,主要表達于細胞膜。11.腦膠質(zhì)瘤模型建立后7 d, SD大鼠右側大腦半球表面出現(xiàn)直徑約1 cm的圓形異常組織,浸潤生長,周邊組織腫脹,中線向左側偏移約1-1.5 mm。12.HE染色可見腫瘤組織密集排列,浸潤性生長,與正常腦部組織分界不清,質(zhì)地較均勻,炎癥細胞浸潤,胞核深染,核質(zhì)比增大,亦可見新生血管生成。13.實驗組BMSCsCM-Dil植入C6/SD大鼠腦膠質(zhì)瘤中2 d,存在于針道損傷部位,7d后BMSCsCM-Dil已大量遷移至腫瘤組織邊緣。結論1.本研究通過hUC-MSCs與MCF-7B乳腺癌細胞及U251腦膠質(zhì)瘤細胞非接觸共培養(yǎng)模型的構建,證實hUC-MSCs受腫瘤微環(huán)境中炎癥性因子作用易通過細胞周期限制點使增殖能力加強,受癌基因壓力信號作用,p53蛋白激活致使不可修復的細胞衰老,防止其惡性轉(zhuǎn)化,維持細胞基因組的穩(wěn)定性,2.成功構建SD大鼠C6腦膠質(zhì)瘤腦內(nèi)模型,CM-Dil熒光標記的BMSCs植入膠質(zhì)瘤內(nèi)定位分布于正常腦組織與膠質(zhì)瘤的交界部位,為BMSCs在體內(nèi)腦膠質(zhì)瘤微環(huán)境中惡性轉(zhuǎn)化的研究提供實驗模型。
【關鍵詞】：hUC-MSCS 腫瘤微環(huán)境 生物學特性 BMSCS
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R73-36
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照4-5
• 中文摘要5-10
• 英文摘要10-17
• 前言17-19
• 第一部分 腫瘤微環(huán)境中hUC-MSCs的生物學特性19-33
• 1 材料與方法19-24
• 2 結果24-28
• 3 討論28-30
• 4 結論30-31
• 參考文獻31-33
• 第二部分 hUC-MSCs在腫瘤微環(huán)境中生物學特性改變的分子機制研究33-47
• 1 材料與方法33-39
• 2 結果39-41
• 3 討論41-44
• 4 結論44-45
• 參考文獻45-47
• 第三部分 SD大鼠C6腦膠質(zhì)瘤腦內(nèi)模型的建立及大鼠BMSCs原位注射后的分布觀察47-57
• 1 材料與方法47-51
• 2 結果51-53
• 3 討論53-54
• 4 結論54-55
• 參考文獻55-57
• 全文總結57
• 創(chuàng)新性與意義57
• 局限性57-58
• 文獻綜述58-66
• 參考文獻63-66
• 致謝66-67
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表學術論文目錄67

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本文編號：902523