本文關(guān)鍵詞：去泛素化酶對PTEN蛋白穩(wěn)定性調(diào)控的研究

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【摘要】：PTEN(phosphatase and tension homologue deleted from chromosome 10)的全稱是定位在10號染色體上,與張力蛋白同源有缺失的磷酸酶基因。含有403個氨基酸組成的編碼蛋白分子,分子量約為56kDa。PTEN蛋白主要包括3個結(jié)構(gòu)功能區(qū),一個氨基端磷酸酶區(qū),一個與脂質(zhì)結(jié)合的C2區(qū)和由約50個氨基酸組成的羧基末端,在細胞中表現(xiàn)出蛋白磷酸酶和脂質(zhì)磷酸酶的雙重特異性磷酸酶活性,是目前為止發(fā)現(xiàn)的首個磷酸酶活性的抑癌基因。它的主要功能是特異性地使磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP3)第3位磷酸基團去磷酸化,從而拮抗PI3K激酶的功能,進而抑制PI3K下游特別是PI3K-AKT這條通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),發(fā)揮著抑制細胞生長、侵襲、增殖和遷移等多種生物學(xué)效應(yīng)。實驗研究發(fā)現(xiàn)近年來在多種腫瘤中存在PTEN的缺失或突變,純合缺失PTEN基因的小鼠胚胎致死,雜合缺失PTEN基因的小鼠則自發(fā)形成多種類型的腫瘤,證明PTEN確實在體內(nèi)具有抑癌基因的功能。鑒于PTEN的重要性,其活性與穩(wěn)定性必然受到嚴(yán)謹(jǐn)?shù)恼{(diào)控,理論上講,蛋白穩(wěn)定性及蛋白量的控制,除了受到轉(zhuǎn)錄水平及蛋白合成的影響外,非常重要的一種機制就是泛素化降解與去泛素化穩(wěn)定的體內(nèi)平衡調(diào)控。泛素連接酶促進底物泛素化修飾而降解；相反,去泛素化酶可以去除底物的泛素化,阻斷蛋白酶體介導(dǎo)的降解,保護底物蛋白使其水平上調(diào)。考慮到泛素化酶與去泛素化酶對維持PTEN蛋白半衰期調(diào)控的重要性,促進PTEN泛素化的E3在調(diào)節(jié)PTEN半衰期中具有重要的功能。相反,抑制PTEN去泛素化修飾、阻斷蛋白酶體降解的DUB在調(diào)節(jié)PTEN半衰期中具有相對更為重要的角色。已報道促進PTEN泛素化的E3有NEDD4-1、WWP2、CHIP、XIAP和 TRIM27/RFP,而促進其去泛素化的DUB報道有HAUSP/USP7和USP13,HAUSP/USP7去除的是PTEN的單泛素化,促使PTEN從細胞核轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì),但并不影響PTEN的蛋白穩(wěn)定性和蛋白量。USP13能夠在細胞質(zhì)中穩(wěn)定PTEN的蛋白水平,去除PTEN的多聚泛素化鏈之間的連接,保護PTEN免受蛋白酶體的降解。既然PTEN在體內(nèi)受到泛素化酶和去泛素化酶的平衡調(diào)控,那么相應(yīng)的調(diào)控PTEN蛋白穩(wěn)定性的去泛素化酶也不止一個,前期我們在實驗中發(fā)現(xiàn)USP10和PTEN存在相互作用,之前報道USP10可以在細胞質(zhì)中拮抗MDM2對p53的降解作用,穩(wěn)定p53的蛋白水平,進而抑制細胞的增殖,侵襲等發(fā)揮重要的抑癌功能。另有研究發(fā)現(xiàn)p53可以影響PTEN的轉(zhuǎn)錄活性,而PTEN反過來也可以影響p53的蛋白活性,那么USP10是否也可以對PTEN發(fā)揮重要的作用并沒有報道,因此圍繞兩者的相互關(guān)系展開以下的實驗研究：1、通過內(nèi)源IP實驗和體外GST pull-down實驗證明USP10和PTEN存在相互作用,在缺失p53的結(jié)直腸癌細胞HCT116也能檢測到兩者存在相互作用,說明USP10對PTEN的調(diào)控作用不依賴p53的調(diào)控。2、間接免疫熒光實驗證明兩者共同定位在細胞質(zhì)中,對細胞進行核質(zhì)分離后同樣證明USP10主要維持細胞質(zhì)中的PTEN蛋白水平。3、蛋白穩(wěn)定實驗證明過表達USP10后可以延長PTEN蛋白的半衰期,敲低USP10蛋白能夠縮短PTEN的半衰期。4、內(nèi)源泛素化實驗證明過表達USP10可以減弱PTEN的泛素化,同樣在敲低USP10的細胞中檢測到PTEN的泛素化增強,說明USP10影響PTEN的穩(wěn)定性是通過蛋白酶體調(diào)控的。5、以USP13為陽性對照,發(fā)現(xiàn)敲低USP10, USP13后兩者對PTEN以及PI3K-AKT通路有相同的負(fù)向調(diào)控作用。6、USP10影響細胞的增殖速度,不影響細胞凋亡功能。因此總的來看USP10能夠維持PTEN的蛋白穩(wěn)定性、維持細胞PTEN適量蛋白水平及調(diào)節(jié)細胞增殖與穩(wěn)態(tài)中具有重要的功能,它可以特異性地去除PTEN的泛素鏈,拮抗PTEN的降解,推測USP10很可能通過維持PTEN蛋白水平來發(fā)揮抑癌功能。
【關(guān)鍵詞】：PTEN USP10 多聚泛素化 蛋白酶體
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R730.5
【目錄】：

• 縮略語5-6
• 中文摘要6-8
• Abstract8-10
• 前言10-13
• 材料與方法13-22
• 結(jié)果22-30
• 討論30-32
• 結(jié)論32-33
• 其他工作33-36
• 參考文獻36-39
• 附錄1：主要儀器設(shè)備39-40
• 附錄2：PCR引物序列40-41
• 附錄3：在讀期間發(fā)表的代表性論文41-46
• 附錄4：個人簡歷46-47
• 致謝47-48
• 綜述48-58
• 參考文獻55-58

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