本文關(guān)鍵詞：microRNA-4754通過調(diào)節(jié)mTOR信號通路發(fā)揮在人胃癌細胞系SGC-7901中的抗腫瘤作用

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【摘要】：背景與目的：胃癌是一類高度侵襲性的惡性腫瘤,屬于我國最常見的惡性腫瘤,其死亡率位居世界第二位,是一類嚴重危害人類健康的疾病,其發(fā)生發(fā)展是多因素共同作用的結(jié)果。microRNA是一類內(nèi)源性的不具有編碼功能的小分子RNA,長度約為22個核苷酸左右。microRNA可通過特異性的互補結(jié)合靶基因的3’或5'非翻譯端發(fā)揮調(diào)節(jié)作用,并可根據(jù)互補程度的不同來抑制其表達或使其降解。microRNA參與細胞的多種生物進程如：細胞增殖、分化、衰老和凋亡等。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)在胃癌中存在著多種microRNA的表達異常,研究發(fā)現(xiàn)這些異常表達的microRNA可以通過調(diào)節(jié)多種途徑影響腫瘤的發(fā)生、浸潤、轉(zhuǎn)移、對藥物及放射治療的敏感性及患者預(yù)后,大量的研究證明microRNA可作為胃癌早期診斷及估計治療效果的生物標記。本研究結(jié)合本課題組之前研究結(jié)果,采用構(gòu)建miR-4754高表達載體并轉(zhuǎn)入人胃癌細胞系SGC-7901中來探究其對人胃癌細胞系SGC-7901的細胞活性、遷移、侵襲及細胞凋亡等的影響,并進一步探究其可能的作用機制,為研究microRNA-4754在人胃惡性腫瘤中的生物學(xué)作用提供了理論基礎(chǔ)。方法：采用聚合酶鏈式反應(yīng)檢測microRNA-4754在六種胃癌細胞AGS, SGC-7901, BGC-823, NCI-N87, MKN-28, MGC-803中的表達量并篩選出表達量最低的一種細胞即SGC-7901,將構(gòu)建的miR-4754過表達慢病毒載體轉(zhuǎn)入SGC-7901細胞系中,再次采用PCR反應(yīng)檢測轉(zhuǎn)染后的miR-4754的表達水平。采用Cell Counting Kit-8和克隆形成實驗檢測細胞活性,Transwell和劃痕實驗檢測細胞遷移、侵襲能力,Flow Cytometry和Hoechst33342/PI熒光雙染檢測細胞凋亡,并通過western blot探究miR-4754可能的作用機制。實驗分為三組,空白組：正常的SGC-7901細胞；對照組：轉(zhuǎn)染空病毒的SGC-7901細胞；實驗組：轉(zhuǎn)染miR-4754過表達慢病毒的SGC-7901細胞。統(tǒng)計分析：采用Graphpad Prism5軟件對結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析,計量資料采用均數(shù)士標準差(x土s)的形式表現(xiàn),兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗,實驗組和對照組之間均數(shù)的比較采用one-way ANOVA方法檢驗,p0.05認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果：1.RT-PCR實驗結(jié)果顯示,在上述六種胃癌細胞中均可以檢測到miR-4754的表達,其表達量在SGC-7901細胞系中最低；且轉(zhuǎn)染microRNA-4754過表達慢病毒載體后其microRNA-4754的表達量明顯升高；2. Cell Counting Kit-8細胞增殖實驗以及細胞克隆形成實驗結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染microRNA-4754過表達載體的SGC-7901細胞其增殖活性及克隆形成率較空白組及對照組相比明顯降低,細胞活性明顯受到抑制；3.Transwell實驗結(jié)果證實,轉(zhuǎn)染miR-4754過表達慢病毒載體的SGC-7901細胞中穿過小室基膜的細胞數(shù)目較對照組及空白組明顯減少,說明細胞遷移及侵襲受到明顯抑制；4.劃痕實驗結(jié)果證實,在相同密度下,經(jīng)過同樣的時間(48h),轉(zhuǎn)染miR-4754過表達慢病毒載體的SGC-7901細胞向中央遷移的距離和對照組及空白組相比明顯減少；6. Flow Cytometry檢測細胞凋亡的結(jié)果表明在同樣的培養(yǎng)條件下,轉(zhuǎn)染miR-4754過表達慢病毒的SGC-7901細胞的凋亡率明顯增加；7. Hoechst33342/PI熒光雙染結(jié)果證實,在同樣的培養(yǎng)條件下,轉(zhuǎn)染miR-4754過表達慢病毒載體的SGC-7901細胞中,PI陽性的細胞比例較對照組及空白組明顯增多,表明SGC-7901細胞在轉(zhuǎn)染microRNA-4754過表達慢病毒載體后細胞凋亡率增高；8.Western Blot結(jié)果顯示,在轉(zhuǎn)染microRNA-4754過表達慢病毒載體的SGC-7901細胞中,其p-mTOR(磷酸化雷帕霉素靶蛋白)的表達量較空白組和對照組明顯降低。結(jié)論：1.microRNA-4754過表達慢病毒構(gòu)建成功且能夠穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人SGC-7901細胞,并能建立穩(wěn)定的過表達miR-4754的SGC-7901細胞系；2. microRNA-4754可以抑制人胃癌細胞系SGC-7901的增殖、克隆形成、遷移、侵襲并且可以誘導(dǎo)細胞凋亡,即microRNA-4754可以在人胃癌細胞系SGC-7901中發(fā)揮抗癌作用；3. microRNA-4754可能通過抑制p-mTOR(磷酸化雷帕霉素靶蛋白)的表達發(fā)揮在人胃癌細胞系SGC-7901細胞中的抗腫瘤作用。
【關(guān)鍵詞】：胃癌 SGC-7901細胞 microRNA-4754 細胞增殖及凋亡 雷帕霉素靶蛋白
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.2
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 符號說明13-14
• 前言14-16
• 材料與方法16-31
• 結(jié)果31-34
• 討論34-38
• 結(jié)論38-39
• 附圖39-44
• 參考文獻44-50
• 綜述50-56
• 參考文獻52-56
• 致謝56-57
• 發(fā)表論文57-58
• 學(xué)位論文評閱及答辯情況表58

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