本文關(guān)鍵詞：探討MCL-1和FBW7蛋白對多倍體腫瘤形成的影響及其作用

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【摘要】：目的:目前,惡性腫瘤仍是威脅人類健康的最大殺手,臨床工作中發(fā)現(xiàn),腫瘤組織的耐藥及復(fù)發(fā)與多倍體細(xì)胞的形成密切相關(guān)。紡錘絲毒性藥物(如紫杉醇、長春新堿等)是腫瘤化療的一線藥物,殺滅腫瘤的重要機(jī)制是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。前期研究發(fā)現(xiàn):這類藥物對有些腫瘤細(xì)胞可誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡,從而達(dá)到治療的目的。而對另一些腫瘤細(xì)胞卻以誘導(dǎo)其產(chǎn)生多倍體為特征,這些多倍體腫瘤細(xì)胞對常用化療藥物更加耐藥,且其形成與BCL-2的高表達(dá)相關(guān)。多倍體腫瘤的形成與多種分子機(jī)制調(diào)控異常有關(guān),BCL-2高表達(dá)所致凋亡逃逸,P21降解所造成的有絲分裂調(diào)控點(diǎn)失控所致有絲分裂滑動、核內(nèi)復(fù)制等可能是多倍體腫瘤形成的重要原因,但目前尚無定論。國外學(xué)者的研究也發(fā)現(xiàn):大約90%的實(shí)體瘤是非整倍體,染色體擴(kuò)增,耐藥表型表達(dá)量增高,使多倍體腫瘤對常用的放、化療極不敏感,具有多倍體亞克隆的腫瘤預(yù)后更差。Wertz IE等人在Nature雜志中研究表明:MCL-1(myeloid cell leukemia-1)作為BCL-2家族重要成員之一,是抗微管化療藥誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的重要調(diào)節(jié)因子,起抗凋亡作用,在有絲分裂間期,FBW7/Cdc4(SKP1-cullin-1-F-box complex,SCFFBW7)該重要的泛素蛋白酶E3可以介導(dǎo)MCL-1蛋白大量泛素化降解,從而使MCL-1蛋白含量水平顯著下降,致使細(xì)胞凋亡。但在卵巢癌、非小細(xì)胞肺癌等多種腫瘤細(xì)胞中常發(fā)現(xiàn),FBW7蛋白缺失或基因突變導(dǎo)致降解腫瘤蛋白功能的喪失,致使MCL-1蛋白降解受阻,MCL-1蛋白水平升高,可促進(jìn)有絲分裂滑動、核內(nèi)復(fù)制,可能是導(dǎo)致多倍體腫瘤形成和對抗微管化療藥耐藥的重要原因,另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)急性T淋巴細(xì)胞白血病(T-ALL)、乳腺癌細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞也存在FBW7缺失,MCL-1過表達(dá)這一普遍現(xiàn)象,FBW7蛋白缺失的T-ALL細(xì)胞對索拉非尼(Sorafenib,多激酶抑制劑)藥物非常敏感,Sorafenib通過抑制MCL-1表達(dá)發(fā)揮抗癌作用,而對BCL-2拮抗劑ABT-737不敏感,如在基因水平重建FBW7或使MCL-1低表達(dá),可使T-ALL細(xì)胞重新恢復(fù)對ABT-737藥物的敏感性,進(jìn)一步說明抑制MCL-1蛋白的表達(dá)可能是臨床治療FBW7蛋白缺失的T-ALL的重要途徑。本實(shí)驗(yàn)通過應(yīng)用紡錘絲毒性藥物Nocodazole、紫杉醇(Taxol)為誘導(dǎo)物,以乳腺癌細(xì)胞mda-mb-231為研究對象,與藥物共同孵育的不同時間點(diǎn)收獲細(xì)胞,觀察細(xì)胞形態(tài)及染色體倍體變化,探討mcl-1和fbw7蛋白在乳腺癌細(xì)胞多倍體形成中的作用,且期望通過sorafenib抑制mcl-1蛋白的表達(dá),達(dá)到減少多倍體細(xì)胞形成的目的,從而提出以減少多倍體腫瘤形成為基礎(chǔ)的防治腫瘤耐藥新策略。方法:1、以紡錘絲毒性藥物100ng/mlnocodazole處理人乳腺癌mda-mb-231細(xì)胞,分別于0h、6h、12h、24h、48h、72h收獲細(xì)胞,顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期和染色體倍體變化,westernblot檢測細(xì)胞中fbw7和mcl-1蛋白的表達(dá)含量。2、用索拉非尼(sorafenib,多激酶抑制劑)分別與nocodazole、紫杉醇(taxol)共同處理細(xì)胞,分別以單用nocodazole或taxol或sorafenib處理細(xì)胞為對照。westernblot檢測處理48h后各組細(xì)胞中mcl-1蛋白的表達(dá),流式細(xì)胞術(shù)檢測處理48h細(xì)胞周期和染色體倍體變化,mtt比色法檢測處理48h和72h細(xì)胞生長增殖率。結(jié)果:1、nocodazole處理細(xì)胞后,隨時間推移細(xì)胞出現(xiàn)體積增大,核大的多倍體形態(tài)學(xué)改變,八倍體細(xì)胞所占百分比顯著增加,分別為0h(0.8±0.2)%、6h(8.5±2.3)%、12h(7.8±2.0)%、24h(9.9±0.9)%、48h(28.2±0.8)%、72h(35.1±4.9)%(f=91.417,p0.001);隨時間推移fbw7蛋白表達(dá)量逐漸減少,mcl-1蛋白表達(dá)量逐漸增加,且48h后差異顯著。2、于48h收獲細(xì)胞后,nocodazole+sorafenib組較nocodazole組mcl-1蛋白表達(dá)量顯著減少,八倍體細(xì)胞所占百分比(8.6±0.1)%明顯低于nocodazole組(28.2±0.8)%(t=12.557,p=0.006),細(xì)胞生長增殖率明顯降低(t=17.872,p0.001);taxol+sorafenib組較taxol組mcl-1蛋白表達(dá)量也顯著減少,八倍體細(xì)胞所占百分比(0.8±0.7)%也明顯低于taxol組(10.5±1.3)%(t=10.92,p0.001),細(xì)胞生長增殖率也明顯降低(t=9.175,p0.001)。結(jié)論:1、fbw7蛋白低表達(dá),mcl-1蛋白高表達(dá)與乳腺癌多倍體細(xì)胞的形成密切相關(guān)。2、索拉非尼(Sorafenib)可能抑制MCL-1蛋白表達(dá),減少多倍體腫瘤細(xì)胞的形成,為臨床攻克腫瘤耐藥提供了新思路。
【關(guān)鍵詞】：多倍性 腫瘤 MCL-1 FBW7 紡錘絲毒性藥物
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R730.5
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 縮略語/符號說明12-14
• 前言14-17
• 研究背景、現(xiàn)狀14-16
• 研究目的、方法16-17
• 1 對象和方法17-29
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料17-21
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法21-28
• 1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法28-29
• 2 結(jié)果29-35
• 2.1 以Nocodazole處理MDA-MB-231細(xì)胞，隨處理時間的推移細(xì)胞出現(xiàn)多倍體化，同時伴有細(xì)胞內(nèi)FBW7蛋白表達(dá)減少，而MCL-1 蛋白表達(dá)逐漸增多29-31
• 2.1.1 多倍體細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化29
• 2.1.2 細(xì)胞周期出現(xiàn)G2/M期停滯和多倍體細(xì)胞（四倍體和八倍體細(xì)胞的形成）29-30
• 2.1.3 多倍體細(xì)胞的形成與FBW7、MCL-1 蛋白表達(dá)的相關(guān)性30-31
• 2.2 通過Sorafenib下調(diào)MCL-1 蛋白，發(fā)現(xiàn)多倍體細(xì)胞生成減少,細(xì)胞生長增殖率降低，，藥物敏感性增加31-35
• 2.2.1 Sorafenib下調(diào)MCL-1 蛋白，同時發(fā)現(xiàn)多倍體細(xì)胞（四倍體和八倍體細(xì)胞）生成減少31-33
• 2.2.2 Sorafenib處理細(xì)胞，細(xì)胞生長增殖率降低，藥物敏感性增加33-35
• 3 討論35-41
• 3.1 多倍體腫瘤的形成可能是臨床上腫瘤耐藥、復(fù)發(fā)的重要原因之一35
• 3.2 MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞系特點(diǎn)及與本實(shí)驗(yàn)的相關(guān)性35
• 3.3 FBW7和MCL-1 蛋白間的關(guān)系及其在多倍體腫瘤形成中的作用35-38
• 3.4 Sorafenib能否抑制MCL-1 蛋白的表達(dá)，減少多倍體細(xì)胞的產(chǎn)生38-39
• 3.5 增加FBW7蛋白量可能有利于抗多倍體腫瘤的形成39-41
• 結(jié)論41-42
• 展望42-43
• 參考文獻(xiàn)43-48
• 綜述48-60
• 綜述參考文獻(xiàn)56-60
• 致謝60

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本文編號：885658